Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-15:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Bệnh động vật biên soạn, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu kỹ thuật, quy trình xét nghiệm và chẩn đoán bệnh xoắn khuẩn (Leptospirosis) gây ra bởi các loài vi khuẩn thuộc chi Leptospira trên động vật.

Phạm vi và đối tượng áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm dịch động vật, cơ sở chăn nuôi và các đơn vị liên quan trong việc chẩn đoán phát hiện bệnh xoắn khuẩn do Leptospira trên các loài động vật nuôi (như lợn, trâu, bò, dê, cừu, chó, mèo) và động vật hoang dã.

Nội dung quy trình chẩn đoán cốt lõi

1. Đặc điểm dịch tễ học và triệu chứng lâm sàng

• Đặc điểm dịch tễ: Bệnh lây truyền chủ yếu qua nguồn nước, thức ăn bị nhiễm nước tiểu của động vật mang trùng (đặc biệt là loài gặm nhấm). Vi khuẩn xâm nhập qua da bị tổn thương hoặc qua niêm mạc mắt, mũi, miệng và đường sinh dục.
• Triệu chứng lâm sàng: Bệnh biểu hiện ở nhiều thể khác nhau bao gồm thể quá cấp tính, cấp tính, bán cấp và mãn tính. Các triệu chứng điển hình gồm sốt cao ngắt quãng, vàng da, niêm mạc vàng, xuất huyết dưới da, tiểu ra huyết sắc tố (nước tiểu màu đỏ hoặc sẫm màu), sảy thai ở gia súc sinh sản hoặc sinh con yếu, giảm sữa đột ngột ở bò sữa.
• Bệnh tích đại thể: Cơ thể vàng da nghiêm trọng, xuất huyết ở các cơ quan nội tạng (phổi, thận, tim), gan sưng to và dễ nát, thận sưng có các điểm hoại tử hoặc xám xịt, bàng quang chứa nước tiểu màu đỏ sẫm.

2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường nuôi cấy

• Thiết bị chính: Kính hiển vi nền đen (dark-field microscope), tủ ấm duy trì nhiệt độ từ 28 độ C đến 30 độ C, máy ly tâm, máy nhân gen PCR, tủ an toàn sinh học cấp 2.
• Hóa chất và môi trường: Môi trường nuôi cấy chuyên dụng như EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) hoặc Korthof có bổ sung huyết thanh thỏ; các cặp mồi PCR đặc hiệu; kháng nguyên và kháng thể chuẩn phục vụ phản ứng ngưng kết.

3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm

• Mẫu máu: Lấy máu tĩnh mạch để tách huyết thanh thực hiện phản ứng ngưng kết vi thể (MAT). Đối với chẩn đoán PCR ở giai đoạn đầu của bệnh, lấy máu toàn phần có chất chống đông.
• Mẫu nước tiểu: Thu thập nước tiểu tươi, tốt nhất là sau khi tiêm thuốc lợi tiểu cho động vật. Mẫu cần được trung hòa độ pH và xét nghiệm ngay trong vòng vài giờ.
• Mẫu phủ tạng: Thu thập thận, gan, dịch buồng tử cung hoặc thai sảy từ động vật chết hoặc sảy thai. Mẫu phải được giữ lạnh ở nhiệt độ từ 2 độ C đến 8 độ C và vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm.

4. Các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm

• Phương pháp soi kính hiển vi nền đen: Quan sát trực tiếp sự di động đặc trưng của xoắn khuẩn (di động xoay tròn, uốn cong hai đầu hình móc) từ mẫu nước tiểu, dịch ép phủ tạng hoặc máu. Đây là phương pháp định hướng nhanh nhưng độ nhạy không cao.
• Phương pháp nuôi cấy phân lập: Cấy mẫu bệnh phẩm vào môi trường lỏng hoặc bán rắn EMJH, ủ ở nhiệt độ 28 độ C đến 30 độ C trong tối và kiểm tra định kỳ hàng tuần dưới kính hiển vi nền đen để phát hiện sự phát triển của xoắn khuẩn.
• Phản ứng ngưng kết tan vi thể (MAT - Microscopic Agglutination Test): Đây là phương pháp tiêu chuẩn vàng để xác định kháng thể đặc hiệu và định danh nhóm huyết thanh (serogroup) gây bệnh. Phản ứng sử dụng các chủng Leptospira sống làm kháng nguyên để phản ứng với huyết thanh của động vật nghi mắc bệnh.
• Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction): Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen đích của Leptospira (như gen LipL32 hoặc 16S rRNA). Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, cho kết quả nhanh chóng ngay cả ở giai đoạn sớm của bệnh.

5. Đánh giá và kết luận kết quả

• Động vật được kết luận mắc bệnh xoắn khuẩn Leptospira khi có các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình kết hợp với ít nhất một trong các kết quả xét nghiệm phòng thí nghiệm dương tính (phân lập được vi khuẩn, kết quả PCR dương tính, hoặc hiệu giá kháng thể MAT đạt ngưỡng chẩn đoán theo quy định đối với từng loài động vật đã hoặc chưa tiêm phòng vắc xin).

Hiệu lực thi hành

TCVN 8400-15:2019 có hiệu lực kể từ ngày ban hành, thay thế hoặc bổ sung các quy trình chẩn đoán bệnh Leptospira trước đây nhằm thống nhất kỹ thuật xét nghiệm trên phạm vi toàn quốc.