TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TVCN 8400-43: 2019

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 43: BỆNH LƯỠI XANH

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 43: Bluetongue Disease

Lời nói đầu

TCVN 8400-43: 2019 do Chi cục Thý y vùng VI - Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) và các bài báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần:

- TCVN 8400-1: 2019, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2: 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3: 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4: 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

- TCVN 8400-5: 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6: 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7: 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8: 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9: 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10: 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11: 2019, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12: 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13: 2019, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-14: 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15: 2019, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16: 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

- TCVN 8400-17: 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18: 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19: 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20: 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21: 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22: 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23: 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24: 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25: 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26: 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27: 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28: 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29: 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30: 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31: 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32: 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33: 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34: 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35: 2015, phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36: 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

- TCVN 8400-37: 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38: 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Coronavirus;

- TCVN 8400-39: 2016, phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40: 2016, phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra;

- TCVN 8400-41: 2019, phần 41: Bệnh dịch tả lợn Châu Phi;

- TCVN 8400-42: 2019, phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại;

- TCVN 8400-43: 2019, phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44: 2019, phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45: 2019, phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46: 2019, phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47: 2019, phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển.

 

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 43: BỆNH LƯỠI XANH

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 43: Bluetongue Disease

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh lưỡi xanh đối với động vật nhai lại.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8402: 2010 Bệnh động vật - Quy trình mổ khám.

3  Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

3.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Bệnh lưỡi xanh (Bluetongue disease) là bệnh truyền nhiễm do vi rút Bluetongue thuộc họ Reoviridae gây ra cho nhiều loài nhai lại bao gồm động vật nuôi và động vật hoang dã. Thú mắc bệnh có thể bị sung huyết nghiêm trọng với tỷ lệ tử vong cao ở cừu và hươu. Động vật nhai lại như bò, dê hiếm khi có triệu chứng lâm sàng.

CHÚ THÍCH: Vi rút Bluetongue có 27 typ huyết thanh được tìm thấy trên toàn thế giới, có đến 9 typ huyết thanh (1, 2, 3, 7, 9, 12, 16, 21 và 23) của vi rút Bluetongue ở khu vực Đông Nam Á và 11 typ huyết thanh ở Trung Quốc (1, 2, 3, 4, 9, 11, 12, 15, 16, 21 và 23) đã được phát hiện.

3.2  Từ viết tắt

- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược;

- PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát;

- DNAse (Deoxyribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ADN;

- RNAse (Ribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ARN;

- ELISA (Enzyme- linked immunosorbent assay): Phản ứng miễn dịch liên kết enzyme;

- BTV (Bluetongue virus): vi rút Bluetongue;

- ARN: Axít ribonucleic;

- ADN: Axít deoxyribonucleic;

- TBE 10X (Tris-axit boric- Ethylendiamin Tetraacetic axit): Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần;

- Ct (cycle threshold): giá trị chu kỳ ngưỡng.

4  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết, phân tích, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có DNAse và RNAse, trừ khi có quy định khác.

4.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho lấy mẫu

4.1.1  Ống nghiệm sạch, vô trùng và có chất chống đông EDTA;

4.1.2  Cồn (Ethanol), từ 70 % đến 100 %;

4.1.3  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem Phụ lục A).

4.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA

4.2.1  Kít ELISA, sử dụng kít thương mại có sẵn trên thị trường được dùng để phát hiện kháng thể vi rút Bluetongue, khi sử dụng cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.3  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp RT-PCR/ realtime RT-PCR

4.3.1  Kít chiết tách ARN/ADN vi rút;

4.3.2  Bộ kít nhân gen;

4.3.3  Mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò;

4.3.4  Mẫu chuẩn dương, được chứng nhận là dương tính hoặc ARN chuẩn dương tách chiết từ vi rút Bluetongue có giá trị Ct đã biết trước;

4.3.5  Nước tinh khiết, không có DNAse và RNAse;

4.3.6  Bột agarose, dung dịch Tris-borate-EDTA(TBE) 10X;

4.3.7  Chất nhuộm gel (GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

4.3.8  Dung dịch nạp mẫu (Loading dye);

4.3.9  Thang chuẩn DNA 100bp.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị dụng cụ sau:

5.1  Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

5.1.1  Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0°C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

5.1.2  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

5.1.3  Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

5.1.4  Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, vô trùng;

5.1.5  Xy lanh và kim tiêm loại 18G;

5.1.6  Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

5.2  Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp RT- PCR/ realtime RT- PCR

5.2.1  Máy PCR, realtime PCR;

5.2.2  Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có);

5.2.3  Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

5.2.4  Máy lắc ủ nhiệt;

5.2.5  Máy spindown, máy ly tâm lắng;

5.2.6  Bồn điện di;

5.2.7  Máy đọc gel.

5.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA

5.3.1  Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng từ 450 nm đến 650 nm;

5.3.2  Thiết bị ủ mẫu, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 °C.

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Dịch tễ học

Bệnh lưỡi xanh (Bluetongue virus - BTV) gây bệnh trên loài nhai lại, bao gồm cừu, trâu, bò, hươu, nai dê và lạc đà. Bệnh do Orbivirus thuộc họ Reoviridae (ARN vi rút) gây ra. Gia súc mắc bệnh có đặc điểm sốt cao, phù thũng, lưỡi chuyển màu xanh, tác nhân truyền bệnh là do côn trùng, đặc biệt là loài muỗi vằn có tên là Culicoides imicola, hoặc có thể do tiêm truyền qua máu, tinh dịch. Tuy không gây nguy hiểm cho người, nhưng loại vi rút này lây lan rất nhanh trong gia súc và gây tỷ lệ tử vong cao. Tỷ lệ mắc bệnh ở cừu có thể đạt 100 % với tỷ lệ tử vong từ 0 % đến 30 % hoặc có thể lên đến 70 % ở các giống nhạy cảm; BTV thường nghiêm trọng trên hươu đuôi trắng và linh dương (gạt, sừng có nhiều nhánh) với tỷ lệ mắc bệnh 100 % và tỷ lệ tử vong có thể đạt tới 90 %. Nhiều trâu, bò nhiễm BTV serotype 8 ở châu Âu với tỷ lệ nhiễm 5 %, nhưng hiếm khi chết tỷ lệ tử vong dưới 1 %.

6.2  Triệu chứng lâm sàng

Thời gian ủ bệnh: Ở cừu, thường từ 5 ngày đến 10 ngày. Trâu bò nhiễm vi rút huyết sau 4 ngày bị nhiễm bệnh, nhưng hiếm có triệu chứng lâm sàng. Dấu hiệu lâm sàng của bệnh thay đổi rõ rệt về mức độ nghiêm trọng, tùy theo loài hoặc chủng vi rút lây nhiễm, các yếu tố chăn nuôi cũng như giống vật nuôi.

Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh lưỡi xanh chủ yếu là do tính thấm của mạch máu bao gồm sốt, sung huyết dẫn đến phù nề mặt, mí mắt và tai; môi và lưỡi có thể bị sưng to. Đôi khi lưỡi bị tím tái và nhô ra khỏi miệng. Miệng thường lở loét, các vết loét lan rộng, niêm mạc bị hoại tử và bong tróc. Sung huyết có thể xuất hiện ở vành móng, háng gây đau móng và thoái hóa cơ, thú thường bị què và có thể bị tróc móng nếu sử dụng để kéo xe. Thú cái mang thai có thể bị xảy thai hoặc đẻ non. Các dấu hiệu lâm sàng khác bao gồm quẹo cổ, nôn mửa, viêm phổi hoặc viêm kết mạc. Tuy nhiên, trong những trường hợp nhẹ của bệnh, chỉ quan sát thấy tình trạng sung huyết nhẹ, mũi bị loét và chứa dịch tiết.

6.3  Bệnh tích

Xuất huyết động mạch phổi là đặc trưng của bệnh này.

Tắc nghẽn, phù nề, xuất huyết và loét niêm mạc tiêu hóa và hô hấp (miệng, thực quản, dạ dày, ruột, niêm mạc tuyến yên, niêm mạc khí quản).

Xuất huyết điểm và lở loét trong khoang miệng, đặc biệt là trên lưỡi và niêm mạc miệng có thể bị hoại tử hoặc tím tái.

Niêm mạc mũi và vòm họng có thể phù hoặc tím tái, xuất huyết khí quản và tắt nghẽn.

Viêm phế quản phổi hai bên nặng (khi xảy ra biến chứng); trong trường hợp tử vong, phổi có thể tăng can xi máu nội tạng, phù phế nang phổi nặng và phế quản có thể chứa đầy bọt khí và chất lỏng

Có thể sung huyết và loét ở dạ múi khế. Xuất huyết điểm, tụ máu và hoại tử ở tim.

Một vài trường hợp, sung huyết, xuất huyết và phù thấy trên khắp cơ quan nội tạng.

Các cơ xương có thể xuất huyết hoặc hoại tử và bên trong các tế bào có chất lỏng gây phù nề.

Phì đại hạch bạch huyết và lách sưng to.

7  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1  Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

7.1.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo hướng dẫn của quy trình mổ khám TCVN 8402:2010.

Mẫu bệnh phẩm: máu kháng đông, lách, hạch bạch huyết, hạch amidan, thận, dịch nổi tế bào sau khi phân lập vi rút để phát hiện vi rút. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng vi rút Bluetongue.

CHÚ THÍCH: Đối với máu chống đông dùng kim tiêm vô trùng 18G (5.1.5) lấy khoảng 5 ml máu của động vật đang sốt nghi mắc bệnh cho vào ống nghiệm có chất chống đông EDTA (4.1.1), lắc nhẹ.

Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện từ 2 °C đến 8 °C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C. Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C tối đa trong 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ âm 20 °C (đối với mẫu huyết thanh) và ở âm 80 °C (đối với mẫu bệnh phẩm khác).

7.1.2  Xử lý mẫu bệnh phẩm

Tạo huyễn dịch 10% từ mẫu bệnh phẩm (lách, hạch amidan, hạch bạch huyết, thận) trong dung dịch PBS (4.1.3) vô trùng (ví dụ: nghiền 1 g mẫu bệnh phẩm trong 9 ml dung dịch PBS (4.1.3)). Sau đó ly tâm huyễn dịch 2500 g trong 15 phút bằng máy ly tâm (5.2.3). Thu dịch nổi để chẩn đoán phát hiện vi rút Bluetongue bằng phương pháp realtime RT-PCR hoặc RT- nested PCR.

7.2  Phát hiện kháng nguyên

7.2.1  Phương pháp realtime RT-PCR

7.2.1.1  Chiết tách ARN

- Sử dụng kít chiết tách ARN vi rút Bluetongue theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96 1), hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách ARN vi rút (tham khảo Phụ lục B).

- ARN vi rút sau khi chiết tách được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

7.2.1.2  Tiến hành phản ứng

- Chuẩn bị mồi và đoạn dò cho phản ứng realtime RT-PCR: Trình tự mồi và đoạn dò để phát hiện vi rút Bluetongue (tham khảo Bảng C.1, Phụ lục C).

CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi và đoạn dò cần tham khảo khuyến cáo của OIE cập nhật mới để lựa chọn phù hợp.

- Tiến hành phản ứng realtime RT-PCR: Sử dụng cặp mồi và đoạn dò với nồng độ thích hợp (tham khảo bảng C.2, phụ lục C) đã chuẩn bị và bộ kít pha hỗn hợp phản ứng (master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng kít Master mix SuperScript ^® III Platinum ^® One step Quantitative RT-PCR system 2), Cat. No.: 11732-020 của hãng Invitrogen (nếu áp dụng kít khác có thể thay đổi công thức master mix).

- Lượng hỗn hợp nhân gen cho 1 phản ứng (tham khảo Bảng C.2, Phụ lục C).

- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu master mix tiến hành:

+ Cho 20μl hỗn hợp master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 μl ARN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix;

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng realtime PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl ARN dương chuẩn của vi rút Bluetongue (mẫu ARN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút Bluetongue) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR vào máy realtime PCR (5.2.1) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng realtime PCR (tham khảo Bảng C.3, Phụ lục C).

- Kết quả của phản ứng realtime RT-PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính không có Ct.

Với điều kiện phản ứng:

+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct ≤ 37

+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 37 < Ct ≤ 45

- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh lưỡi xanh khi kết quả realtime RT-PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

7.2.2  Phương pháp RT- nested PCR

7.2.2.1  Chiết tách ARN

Xem 7.2.1.1.

7.2.2.2  Tiến hành phản ứng

- Chuẩn bị mồi cho phản ứng RT-PCR: Trình tự và nồng độ mồi phát hiện vi rút Bluetongue (tham khảo Bảng D.1, Phụ lục D).

CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi cần tham khảo khuyến cáo của OIE cập nhật mới để lựa chọn mồi phù hợp.

- Tiến hành phương pháp RT-PCR (tham khảo Phụ lục D).

7.3  Phát hiện kháng thể

Phương pháp ELISA

Kít ELISA được sử dụng phát hiện kháng thể kháng nguyên VP7 của vi rút Bluetongue trong huyết thanh hoặc huyết tương trâu, bò, dê, cừu (tham khảo Phụ lục E).

8  Kết luận

Động vật nhai lại được xác định mắc bệnh lưỡi xanh khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh lưỡi xanh và phải có kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:

- Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện vi rút dương tính.

- Phương pháp RT- nested PCR phát hiện vi rút dương tính.

- Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể dương tính ở động vật nhai lại chưa tiêm phòng.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch muối đệm phốt phát pH ~ 7,2 (PBS).

Thành phần

Natri clorua (NaCl)	8,0 g
Kali clorua (KCl)	0,2 g
Natri hydrophosphat (Na2HPO4)	1,15 g
Kali dlhydrophosphat (KH2PO4)	0,2 g
Nước cất	1000 ml

Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch Tris - borate - EDTA (TBE) 10X

Thành phần

89mM Tris base (FW = 121)	108 g
89 mM Boric acid (FW = 61,8)	55 g
0.5 M EDTA (pH 8,0)	40 ml
Nước cất	1000 ml
Cách chuẩn bị

Hòa tan 89mM Tris base, c89 mM Boric acid và 0,5 M EDTA vào trong 1000 ml nước cất.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp.

Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 μl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị (7.1.2). Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 μl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.5) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.4) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 μl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 μl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 μl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện vi rút Bluetongue

Bảng C.1 - Trình tự mồi và đoạn dò

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng realtime RT-PCR

Thành phần nguyên liệu (Theo hướng dẫn của kít Invitrogen Superscript III qRT-PCR Kit)	Nồng độ μM	Thể tích cho 1 phản ứng μl
Nước không có ARN và ADN		3,25
Dung dịch đệm 2X		12,5
Mồi xuôi BTV	20	1,25
Mồi ngược BTV	20	1,25
Đoạn dò BTV	6	1,25
Enzyme mix		0,5
Mẫu chiết tách (ARN)		5
Tổng thể tích cho 1 phản ứng		25

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR

Nhiệt độ °C	Thời gian	Số chu kỳ
50 (*)	15 phút (*)	01
95 (*)	2 phút (*)	01
95	15 giây	45
60	45 giây (ghi nhận tín hiệu quang)
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít SuperScript ® III Platinum ® One step Quantitative RT-PCR System, Cat. No.: 11732-020 của hãng Invitrogen.

 

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp RT- nested PCR phát hiện vi rút Bluetongue

D.1  Trình tự mồi

Bảng D.1 - Trình tự mồi xuôi và mồi ngược

STT	Tên mồi	Trình tự (5’-3’)
1	Giai đoạn khuếch đại đầu tiên
	Mồi xuôi BTV	GTT-CTC-TAG-TTG-GCA-ACC-ACC
	Mồi ngược BTV	AGG-CCA-GAC-TGT TTC-CCG-AT
2	Giai đoạn khuếch đại lồng nhau
	Mồi xuôi BTV 1	GCA-GCA-TTT-TGA-GAG-AGC-GA
	Mồi ngược BTV 1	CCC-GAT-CAT-ACA-TTG-CTT-CCT

D.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

D.2.1  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho giai đoạn khuếch đại đầu tiên

- Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít nhân gen PCR. Ví dụ sử dụng bộ kít One Step RT-PCR Kit Cat.No: 210210 3) (tham khảo bảng D.2).

- Tổng thể tích của phản ứng PCR là 25 μl (20 μl hỗn hợp Master mix và 5 μl mẫu ARN):

+ Cho 20 μl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 5 μl ARN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl ARN dương chuẩn của vi rút Bluetongue (mẫu ARN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút Bluetongue) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (hỗn hợp Master mix và mẫu ARN) vào máy PCR (5.2.1) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR (tham khảo bảng D.3).

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng RT-PCR cho giai đoạn khuếch đại đầu tiên

Thành phần nguyên liệu (Theo hướng dẫn của kít QIAGEN One Step RT-PCR Kit)	Nồng độ μM	Thể tích cho 1 phản ứng μl
Nước không có ARN và ADN		12,8
OneStep RT-PCR buffer 5X		5,0
dNTP Mix 10 nM		1,0
Mồi xuôi BTV	25	0,6
Mồi ngược BTV	25	0,6
Enzyme Mix		1,0
Mẫu chiết tách (ARN)		5,0
Tổng cộng		25

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng giai đoạn khuếch đại đầu tiên

Nhiệt độ °C	Thời gian	Số chu kỳ
50 (*)	30 phút (*)	01
95 (*)	15 phút (*)	01
94	45 giây	35
58	45 giây
72	60 giây
72	7 phút	01
Giữ ở 4 °C
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít One Step RT-PCR Kit Cat.No: 210210 (Qiagen).

D.2.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho giai đoạn khuếch đại lồng nhau

- Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít nhân gen PCR. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix HotstarTaq^®Master Mix, Catalogue Number: 203445 4) (tham khảo bảng D.4).

- Tổng thể tích của phản ứng PCR là 25 μl (24 μl hỗn hợp Master mix và 1 μl mẫu DNA giai đoạn khuếch đại đầu tiên):

+ Cho 24 μl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 1 μl mẫu DNA giai đoạn khuếch đại đầu tiên vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 24 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (hỗn hợp Master mix và mẫu ADN giai đoạn khuếch đại đầu tiên) vào máy PCR (5.2.1) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR (tham khảo bảng D.5).

Bảng D.4 - Thành phần phản ứng PCR cho giai đoạn khuếch đại lồng nhau

Thành phần nguyên liệu (Theo hướng dẫn của kít HotStarTaq DNA Polymerase)	Nồng độ μM	Thể tích cho 1 phản ứng μl
Nước không có ARN và ADN		9,5
Mồi xuôi BTV 1	25	1,0
Mồi ngược BTV 1	25	1,0
Dung dịch HotStarTaq Master Mix		12,5
Mẫu DNA giai đoạn khuếch đại đầu tiên		1,0
Tổng thể tích cho 1 phản ứng		25

Bảng D.5 - Chu trình nhiệt cho phản ứng giai đoạn khuếch đại lồng nhau

Nhiệt độ °C	Thời gian	Số chu kỳ
95 (*)	15 phút (*)	01
94	45 giây	28
62	45 giây
72	60 giây
72	7 phút	01
Giữ ở nhiệt độ 4 °C đến khi chạy điện di
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít HotstarTag® Master Mix, Cat. No.: 203445

D.2  Điện di sản phẩm PCR

- Chuẩn bị thạch Agarose (4.3.6) 2 % pha trong dung dịch TBE (4.3.6) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (4.3.7) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch dung dịch nạp mẫu (4.3.8)).

- Sử dụng thang chuẩn ADN 100 bp (4.3.9).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

- Đọc kết quả:

+ Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương 101 bp.

+ Mẫu âm tính: Không có vạch.

- Đánh giá kết quả: có vi rút Bluetongue trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả RT-PCR dương tính. Nếu kết quả nghi ngờ cần lấy sản phẩm PCR giải trình tự gen.

 

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phát hiện kháng thể vi rút Bluetongue bằng phương pháp ELISA

(Ví dụ: Sử dụng bộ kít ID Screen Bluetongue competition, mã sản phẩm BTC-5P của nhà sản xuất ID.VET - Pháp)

E.1  Chuẩn bị nguyên liệu

- Đưa tất cả các nguyên liệu trong bộ kít ổn định ở nhiệt độ phòng (21 °C ± 2 °C) và lắc đều để đồng nhất trước khi sử dụng

- Chuẩn bị dung dịch rửa 1X: Lắc dều dung dịch rửa nồng độ đậm đặc (20X) để chắc chắn dung dịch rửa đã hòa tan hoàn toàn và pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1/20 để được dung dịch rửa nồng độ 1X

E.2  Các bước thực hiện

- Cho 50 μl của Dilution Buffer 2 đến tất cả các giếng phản ứng.

- Cho 50 μl của Positive Control đến giếng A1 và B1.

- Cho 50 μl của Negative Control đến giếng C1 và D1.

- Cho 50 μl mẫu xét nghiệm vào các giếng còn lại.

- Ủ 45 phút ± 4 phút ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C.

- Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng Conjugate 10X theo tỷ lệ 1/10 trong Dilution Buffer 2.

Lưu ý, không rửa đĩa ở bước này.

- Cho thêm vào 100 μl Conjugate 1X đến tất cả các giếng.

- Ủ (30 ± 3) phút ở nhiệt độ (21 ± 5) °C.

- Rửa đĩa 300 μl/giếng, lặp lại 3 lần với nước rửa (Wash Solution).

- Cho 100 μl của Substrate (TMB) vào tất cả các giếng.

- Ủ (15 ± 2) phút ở nhiệt độ (21 ± 5) °C trong tối.

- Cho thêm 100 μl dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) đến tất cả các giếng phản ứng.

- Đọc đĩa và ghi nhận giá trị OD ở bước sóng 450 nm.

E.3  Kết quả

• Đánh giá kết quả

- Giá trị OD trung bình của đối chứng âm (OD Negative control_ OD_NC) lớn hơn 0,7.

OD_NC > 0,700.

- Tỷ lệ giá trị trung bình của đối chứng dương (OD Positive control_OD_PC) và Giá trị OD trung bình của đối chứng âm (OD Negative control_ OD_NC) phải nhỏ hơn 0,3.

OD_PC/OD_NC<0,3.

• Phân tích kết quả

Mỗi mẫu xét nghiệm, được tính theo phần trăm cạnh tranh (S/N %)

Phần trăm cạnh tranh (S/N %) = (OD _mẫu / OD _NC) x 100

• Giải thích kết quả

Phần trăm cạnh tranh trong mẫu được tính như sau:

- Nếu mẫu lớn hơn hoặc bằng 40 % là mẫu âm tính.

- Nếu mẫu nhỏ hơn 40 % là mẫu dương tính.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE (Office International des Epizooties), 2014. Bluetongue (Infection with Bluetongue virus). Chapter 2.1.3. Terrestrial Manual.

[2] AAHL (Australian Animal Health Laboratory), 2014. Bluetongue Virus Real-time TaqMan Genotyping Assays. Molecular Diagnosis.

[3] ID.VET. Competitive ELISA for the detection of antibodies against the BTV VP7 protein in sheep, goat, cattle, buffalo or deer serum or plasma sample (BTC ver 0414 GB).

[4] Hofmann M., Griot C., Chaignat V., Perler L. and Thür B., 2008. Bluetongue disease reaches Switzerland. Schweiz. Arch. Tierheilk.,150: 49-56

---