Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-9:2011

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-9:2011 do Viện Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Tiêu chuẩn này quy định chi tiết quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan vịt typ I (Duck Hepatitis Virus Type I) - một bệnh truyền nhiễm cấp tính cực kỳ nguy hiểm ở vịt con, đặc trưng bởi khả năng lây lan nhanh và tỷ lệ tử vong rất cao, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm.

1. Phạm vi áp dụng và tài liệu viện dẫn

• Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán lâm sàng và các phương pháp xét nghiệm phòng thí nghiệm áp dụng đối với bệnh viêm gan vịt do vi rút viêm gan vịt typ I gây ra trên đối tượng vịt và ngan.
• Tài liệu viện dẫn: Việc áp dụng tiêu chuẩn này cần kết hợp với các quy trình chuẩn về an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm thú y và các hướng dẫn vận hành thiết bị chuyên ngành liên quan để đảm bảo tính chính xác và an toàn tuyệt đối.

2. Thuật ngữ và định nghĩa bệnh học

Bệnh viêm gan vịt typ I là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút thuộc họ Picornaviridae gây ra. Bệnh có đặc điểm dịch tễ học là lây lan rất nhanh, diễn biến cực kỳ nhanh chóng và gây tỷ lệ chết lên đến 95% ở vịt con dưới 6 tuần tuổi, đặc biệt mẫn cảm nhất là vịt dưới 3 tuần tuổi.

3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và thuốc thử yêu cầu

Để thực hiện quy trình chẩn đoán một cách chính xác, phòng thí nghiệm cần được trang bị đầy đủ các trang thiết bị và hóa chất chuyên dụng sau:

• Thiết bị và dụng cụ: Tủ lạnh sâu (từ âm 20 độ C đến âm 80 độ C), máy ly tâm lạnh tốc độ cao, máy nhân gen PCR (máy luân nhiệt), tủ an toàn sinh học cấp II, bộ điện di và nguồn điện di, máy chụp ảnh gel, kính hiển vi quang học, các loại pipet tự động có thể tích thay đổi và bộ dụng cụ mổ khám vô trùng.
• Hóa chất và thuốc thử: Các bộ kit tách chiết RNA chuyên dụng, enzyme sao chép ngược (RT), enzyme Taq polymerase, các cặp mồi đặc hiệu (primers) dùng cho phản ứng RT-PCR để phát hiện vi rút viêm gan vịt typ I, nước cất không có nuclease, agarose, đệm điện di (như TAE hoặc TBE), chất nhuộm DNA an toàn và kháng huyết thanh chuẩn hoặc kháng thể đơn dòng kháng vi rút viêm gan vịt typ I.

4. Quy trình chẩn đoán lâm sàng và bệnh tích đại thể

Chẩn đoán lâm sàng và quan sát bệnh tích là bước định hướng quan trọng đầu tiên tại thực địa trước khi tiến hành các xét nghiệm chuyên sâu:

• Đặc điểm dịch tễ học: Bệnh xảy ra chủ yếu ở vịt con dưới 6 tuần tuổi. Vịt càng nhỏ tuổi thì tỷ lệ tử vong càng cao. Bệnh lây lan nhanh chóng qua đường tiêu hóa do thức ăn, nước uống bị nhiễm mầm bệnh, hoặc qua đường hô hấp và tiếp xúc trực tiếp giữa vịt ốm và vịt khỏe.
• Triệu chứng lâm sàng: Thời gian ủ bệnh rất ngắn, chỉ từ 18 giờ đến 48 giờ. Vịt bệnh ban đầu có biểu hiện lờ đờ, tụt lại sau đàn, bỏ ăn, mắt nhắm nghiền và nằm im một chỗ. Sau đó, các triệu chứng thần kinh xuất hiện nhanh chóng: vịt bị co giật, bơi xoay vòng, ngã ngửa ra sau, hai chân duỗi thẳng về phía sau, đầu ngoẹo ra sau hoặc sang một bên (tạo tư thế ưỡn cong người đặc trưng gọi là opisthotonus) và chết chỉ sau vài phút xuất hiện triệu chứng thần kinh.
• Bệnh tích đại thể khi mổ khám: Bệnh tích tập trung chủ yếu và rõ ràng nhất ở gan. Gan vịt bệnh sưng to, mềm, dễ nát, trên bề mặt gan xuất hiện nhiều điểm xuất huyết lấm tấm hoặc xuất huyết thành vệt không đều. Thận sưng to, sung huyết đỏ, các mạch máu nổi rõ. Lách sưng to và nhạt màu hơn bình thường.

5. Quy trình chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Để đưa ra kết luận khẳng định cuối cùng, bắt buộc phải thực hiện các xét nghiệm phòng thí nghiệm theo đúng trình tự kỹ thuật:

• Lấy mẫu và xử lý bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm tốt nhất là gan, lách hoặc não của vịt nghi mắc bệnh hoặc vừa mới chết. Mẫu phải được lấy bằng dụng cụ vô trùng, đựng trong lọ hoặc túi nilon chuyên dụng, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 độ C đến 8 độ C và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. Nếu chưa tiến hành xét nghiệm ngay, mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 70 độ C hoặc tối thiểu là âm 20 độ C.
• Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược): Đây là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất hiện nay để phát hiện RNA của vi rút viêm gan vịt typ I. Quy trình gồm các bước: tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm gan hoặc lách; thực hiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu theo quy định của tiêu chuẩn; điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose và đọc kết quả dưới máy quét hoặc đèn đọc gel. Mẫu được coi là dương tính khi xuất hiện vạch sáng có kích thước băng DNA hoàn toàn trùng khớp với kích thước của mẫu đối chứng dương.
• Phương pháp phân lập vi rút: Nghiền mẫu bệnh phẩm thành hũ dịch 10% trong dung dịch đệm sinh lý, xử lý bằng kháng sinh phổ rộng để tiêu diệt vi khuẩn tạp nhiễm, sau đó ly tâm lấy nước trong. Tiêm dịch lọc này vào xoang niệu của trứng vịt hoặc trứng gà có phôi từ 10 ngày đến 14 ngày tuổi. Theo dõi sự chết của phôi và các biến đổi bệnh tích trên phôi (phôi thường chết sau 2 đến 5 ngày, phôi bị xuất huyết toàn thân, gan phôi sưng to và có màu vàng nhạt).
• Phản ứng trung hòa (Neutralization Test): Sử dụng để định danh chính xác vi rút đã phân lập được bằng cách trộn dịch vi rút với kháng huyết thanh chuẩn của vi rút viêm gan vịt typ I, sau đó tiêm vào phôi trứng hoặc vịt con mẫn cảm để kiểm tra khả năng trung hòa độc lực của kháng thể đặc hiệu.

6. Đánh giá và kết luận kết quả chẩn đoán

Một ca bệnh hoặc một đàn vịt được kết luận chính thức là mắc bệnh viêm gan vịt typ I khi đáp ứng đầy đủ các tiêu chí sau:

• Đàn vịt có các đặc điểm dịch tễ học phù hợp, triệu chứng lâm sàng điển hình (co giật, chết nhanh trong tư thế ưỡn cong người) và bệnh tích đại thể đặc trưng ở gan (gan sưng, xuất huyết vệt).
• Kết quả xét nghiệm phòng thí nghiệm cho kết quả dương tính bằng phương pháp RT-PCR hoặc phân lập được vi rút viêm gan vịt typ I và được định danh chính xác bằng phản ứng trung hòa hoặc các phản ứng huyết thanh học tương đương.