TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-20 : 2014

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 20: BỆNH ĐÓNG DẤU LỢN

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 20: Swine erysipelas

Lời nói đầu

TCVN 8400-20 : 2014 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 20: BỆNH ĐÓNG DẤU LỢN

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 20: Swine Erysipelas

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm cho người xét nghiệm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Khi áp dụng tiêu chuẩn người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác phù hợp để đảm bảo an toàn sức khỏe và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn do vi khuẩn Erysipelothrix rhusiopathiae gây ra.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh đóng dấu lợn (Swine Erysipelas)

Bệnh truyền nhiễm, triệu chứng điển hình của bệnh là trên da có những đám xuất huyết theo hình vuông, hình tròn, do vi khuẩn Gram dương Erysipelothrix rhusiopathiae (E. rhusiopathiae) gây ra.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1. Môi trường nước thịt

3.2. Môi trường thạch máu, thạch cơ bản được bổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu thỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

3.3. Huyết thanh ngựa.

3.4. Động vật thí nghiệm: chuột bạch hoặc chim bồ câu.

3.5. Bộ thuốc nhuộm Gram (Phụ lục A).

3.6. Thuốc nhuộm Giemsa (Phụ lục B).

3.7. Bộ giám định sinh hóa (Phụ lục C).

3.8. Nguyên liệu cho PCR (Phụ lục D).

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

4.1. Tủ ấm, duy trì ở nhiệt độ 37 °C, có chứa 5 % CO₂.

4.2. Kính hiển vi quang học: có vật kính với độ phóng đại 10 lần, 40 lần, 100 lần.

4.3. Đèn cồn.

4.4. Phiến kính, sạch.

4.5. Que cấy, vô trùng.

4.6. Ống nghiệm, sạch, vô trùng.

4.7. Que cấy chích sâu, vô trùng

5. Cách tiến hành

5.1. Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1. Đặc điểm dịch tễ

- Vi khuẩn có thể phân lập được từ khoảng 50 loài động vật bao gồm: chim, cá, bò sát, động vật có vú; nhưng vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở lợn. Lợn 3 tháng đến 3 năm tuổi mẫn cảm nhất với bệnh, lợn dưới 2 tháng tuổi ít mắc bệnh do có miễn dịch thụ động.

- Vi khuẩn có thể gây bệnh ở người, nguy cơ mắc bệnh đóng dấu cục bộ tại nơi da có vết trầy xước. Một số trường hợp người mắc bệnh bị viêm nội tâm mạc và bại huyết cấp tính. Hiện nay chưa có bằng chứng cho thấy bệnh lây từ người sang người.

- Bệnh lây truyền trực tiếp do tiếp xúc giữa lợn mắc bệnh và lợn khỏe hoặc gián tiếp qua các yếu tố trung gian như: phân, nước tiểu, chất độn chuồng hoặc chất tiết của miệng, mũi.

- Bệnh đóng dấu lợn có thể xảy ra quanh năm, nhưng chủ yếu là mùa hè và cuối mùa đông sang mùa xuân.

- Lợn khỏe mạnh có thể mang trùng, vi khuẩn thường cư trú tại hạch amiđan và các tổ chức lympho.

- Tỷ lệ nhiễm bệnh cao và tỷ lệ chết cao ở những nơi không được tiêm phòng.

5.1.2. Triệu chứng lâm sàng

5.1.2.1. Thể cấp tính hoặc nhiễm trùng máu

- Lợn mắc bệnh sốt cao 40 °C - 42 °C, điên cuồng, húc đầu vào tường hoặc hộc máu ra mà chết. Một vài lợn chết đột ngột khi chưa có triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của bệnh. Người ta gọi thể này là "Đóng dấu lợn trắng".

- Lợn bỏ ăn, mắt đỏ ngầu, chảy nước mắt, nước mũi và khó thở.

- Đi lại khập khiễng và thường nằm một chỗ.

- Lợn nái chửa thường bị sảy thai. Lợn trưởng thành thường ỉa phân táo, phân có màng bọc lầy nhầy. Lợn nhỏ hơn có thể ỉa chảy.

- Lợn mắc bệnh sau 2 đến 3 ngày, trên da xuất hiện các đám đỏ hay đỏ tía nổi như mề đay hình vuông hay hình thoi, đặc biệt là ở tai, cổ, bụng, trong đùi và đuôi. Nếu lợn không chết thì phần da bị hoại tử, khô, cứng, sẫm màu tạo thành vảy, lúc này rất dễ bị nhiễm trùng kế phát, đặc biệt là ở vùng cổ và đuôi.

- Bệnh tiến triển từ 3 đến 5 ngày, lợn yếu dần, khó thở, thân nhiệt giảm, kiệt sức mà chết.

- Ở thể cấp tính, tỷ lệ chết 50 % đến 60 %.

5.1.2.2. Thể á cấp tính

Thể á cấp tính biểu hiện nhẹ hơn thể cấp tính. Lợn không có biểu hiện ốm, không sốt cao, không bỏ ăn, có một số triệu chứng ngoài da.

5.1.2.3. Thể mãn tính

Lợn bệnh ở thể cấp tính mà không chết, bệnh kéo dài chuyển sang thể mãn tính. Lợn ăn uống kém, gầy còm, thiếu máu, thân nhiệt bình thường hoặc sốt nhẹ. Lợn có 3 triệu chứng chủ yếu:

- Có tổn thương ở da: da bị hoại tử ở nhiều nơi, rụng lông, da dày lên và bị tróc ra đặc biệt ở vùng tai và đuôi.

- Viêm đa khớp, hay gặp ở khớp bàn chân, khớp gối làm cho lợn bị què, đi khập khiễng hoặc có thể nằm liệt một chỗ không đi lại được.

- Viêm nội tâm mạc: làm tắc hoặc trở ngại tuần hoàn gây phù thũng ở phổi, ở chân, có thể bị liệt chân sau do tắc mạch:

5.1.3. Bệnh tích đại thể

5.1.3.1. Thể cấp tính

- Trên da xuất hiện đám xuất huyết hình thoi hay hình vuông. Mô liên kết dưới da tụ máu, thấm nước nhớt màu đỏ. Niêm mạc tụ máu, xuất huyết.

- Lách sưng to và tụ huyết, bề mặt sần sùi, nổi phồng từng chỗ. Lách mềm, cắt ra có màu nâu.

- Thận sưng to, tụ huyết, vỏ thận có chấm xuất huyết do viêm tiểu cầu thận.

- Tim, gan, phổi tụ huyết. Ngoại tâm mạc có tích dịch vàng. Màng bao tim có lấm chấm xuất huyết.

- Hạch lympho sưng, phù nề, có xuất huyết lấm chấm.

- Viêm cata xuất huyết ở dạ dày, ruột (nhất là đoạn tá tràng, không tràng, hồi tràng).

5.1.3.2. Thể mãn tính

- Hoại tử trên da.

- Viêm khớp.

- Viêm van tim, đặc biệt là van 2 lá (van tim trái) viêm ở thể loét sủi như hoa súp lơ.

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.2.1. Lấy mẫu

Bệnh phẩm bao gồm:

Lợn sống: lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ hoặc ở tai hoặc ở đuôi. Lấy máu có bổ sung chất chống đông là heparin, citrat natri hoặc ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA).

Lợn chết: lấy gan, lách, tim, dịch khớp.

Lấy mẫu vô trùng từ 50 g đến 100 g mỗi loại bệnh phẩm, cho vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu.

Gửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ.

5.2.2. Kiểm tra hình thái vi khuẩn từ bệnh phẩm

5.2.2.1. Cách làm tiêu bản

Bệnh phẩm máu: Lấy một giọt máu nhỏ lên một phiến kính (xem 4.4), sau đó dàn mỏng đều bằng một phiến kính (xem 4.4) khác, để khô.

Bệnh phẩm tổ chức: cắt một miếng nhỏ phủ tạng (gan, lách, tim) phết lên phiến kính (xem 4.4), để khô

5.2.2.2. Cố định tiêu bản

Tiêu bản đã để khô, nhỏ cồn metanol ngập tiêu bản, để khô.

Nhuộm Gram theo quy định của Phụ lục A.

Nhuộm Giemsa theo quy định của Phụ lục B.

5.2.2.3. Xem hình thái vi khuẩn

Nhuộm Gram: vi khuẩn bắt màu tím (màu của Gram dương). Đối với thể cấp tính thấy vi khuẩn có hình sợi ngắn, còn với thể mãn tính thấy vi khuẩn có hình sợi mảnh dài.

Nhuộm Giemsa: vi khuẩn bắt màu xanh, có hình sợi ngắn hoặc sợi mảnh dài.

5.2.3. Tiêm truyền động vật thí nghiệm

Tiêm động vật thí nghiệm (xem 3.4): Máu, phủ tạng (gan, lách) nghiền nát, hòa với nước muối sinh lý 0,9 % theo tỷ lệ 1/10. Tiêm cho chuột bạch (từ 0,1 ml đến 0,2 ml/con), chim bồ câu (từ 0,1 ml đến 0,4 ml/con) vào dưới da, xoang phúc mạc hoặc tĩnh mạch.

Vi khuẩn E. rhusiopathiae làm chết động vật thí nghiệm sau 72 h đến 96 h tiêm bệnh phẩm. Máu và gan của động vật thí nghiệm được lấy để phết phiến kính (xem 4.4) làm tiêu bản kiểm tra trực tiếp dưới kính hiển vi quang học (xem 4.2) và tiến hành phân lập, giám định vi khuẩn.

5.2.4. Phân lập vi khuẩn

Bệnh phẩm được nuôi cấy vào môi trường nước thịt (xem 3.1), môi trường thạch máu (xem 3.2), nuôi ở tủ ấm (xem 4.1) từ 24 h đến 48 h. Vi khuẩn mọc tốt hơn khi môi trường có bổ sung huyết thanh ngựa (xem 3.3).

Môi trường nước thịt (xem 3.1): sau 24 h nuôi cấy, phía trên môi trường trong, phía dưới đáy ống nghiệm có cặn nhày, màu tro, khi lắc lên có vẩn đục như “mây bay”, sau đó môi trường lại trong.

Môi trường thạch máu (xem 3.2): sau 24 h đến 48 h nuôi cấy thấy trên bề mặt thạch xuất hiện khuẩn lạc nhỏ (nhỏ hơn 1 mm), trong suốt, không dung huyết (dung huyết alpha), trông giống như “hạt sương". Có hai loại khuẩn lạc: dạng S (Smooth) - khuẩn lạc nhẵn, láng bóng bề mặt, rìa nhẵn và dạng R (Rough) - khuẩn lạc xù xì, bề mặt không nhẵn bóng, rìa nhăn.

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường thạch máu (xem 3.2) và môi trường nước thịt (xem 3.1) có bổ sung huyết thanh ngựa (xem 3.3), nuôi ở tủ ấm (xem 4.1) từ 24 đến 48 h để kiểm tra đặc tính sinh hóa.

5.2.5. Xác định vi khuẩn

5.2.5.1. Quan sát hình thái vi khuẩn

- Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính (xem 4.4) hoặc lấy một vòng que cấy (xem 4.5) canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn dàn mỏng lên trên phiến kính (xem 4.4), để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn (xem 4.3).

- Tiêu bản sau khi đã được cố định, nhuộm bằng phương pháp Gram (xem Phụ lục A)

- Vi khuẩn E. rhusiopathiae bắt màu tím (gram dương), kích thước (từ 0,2 μm đến 0,4 μm) x (0,5 μm đến 2,5 μm). Nếu nhuộm từ khuẩn lạc dạng S: vi khuẩn có hình sợi ngắn. Nhuộm từ khuẩn lạc dạng R vi khuẩn có hình sợi, mảnh và dài.

5.2.5.2. Kiểm tra đặc tính sinh hóa

Xác định vi khuẩn E. rhusiopathiae dựa vào một số đặc tính sinh hóa được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 - Một số đặc tính sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn E. rhusiopathiae

Kiểm tra đặc tính sinh hóa theo quy định tại Phụ lục C.

5.2.5.3. Xác định vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Các cặp mồi và chu trình nhiệt cho PCR

Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục D.

6. Kết luận

Lợn được xác định là mắc bệnh đóng dấu khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và phân lập được vi khuẩn E. rhusiopathiae trong phòng thí nghiệm có tính chất sinh hóa đặc trưng theo quy định tại 5.2.5.2 hoặc kết quả phản ứng PCR dương tính.

 

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

A.1. Thuốc thử

A.1.1. Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C25H30N3Cl)	2,0 g
Etanol 95 %	20,0 ml
Amoni oxalat [(NH4)2C2O4.2H2O]	0,8 g
Nước	80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2. Dung dịch fuchsin đậm đặc

Fuchsin basic (C20H20ClN3)	1 g
Etanol 95 %	10 ml
Phenol (C6H6O)	5 g
Nước	100ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1:10 (thể tích).

A.1.3. Dung dịch lugol

Kali iodua (KI)	2 g
Iôt (I2) tinh thể	1 g
Nước	200 ml

Nghiền kali iodua và iôt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4. Axeton

Etanol 95 %	3 phần
Axeton (C2H6O)	1 phần

A.2. Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản (đã cố định), để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc sấy khô.

A.3. Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi (xem 4.2) với vật kính độ phóng đại 100 lần.

 

PHỤ LỤC B

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Giemsa

B.1. Thuốc thử

Dung dịch Giemsa đậm đặc

Giemsa dạng bột	1,0 g
Glyxerin [C3H5(OH)3]	66 ml
Metanol nguyên chất	66 ml

Làm nóng glyxerin đến khoảng 55 °C đến 60 °C trong nồi đun cách thủy. Thêm thuốc nhuộm Giemsa trộn đều và ủ trong 2 h. Sau đó để nguội và thêm cồn methanol vào và giữ trong khoảng 2 tuần trước khi sử dụng.

Khi sử dụng pha loãng theo tỷ lệ 1/10 (phần thể tích) trong dung dịch đệm phosphate 0,01 M (pH = 7,0) và giữ trong 30 min.

Dung dịch đệm phosphate

Dung dịch Natri phosphat, Na2HPO4 (9,47 g /l) hoặc Na2HPO4.2H2O (11,87 g /l)	61,1 ml
Dung dịch Kali phosphat, KH2PO4 (9,08 g /I)	38,9 ml
Nước	900 ml

CHÚ THÍCH: có thể sử dụng thuốc nhuộm Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.2. Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản (đã cố định), để trong 20 min đến 30 min, rồi rửa nhanh với nước và sấy khô.

B.3. Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi (xem 4.2) với vật kính độ phóng đại 100 lần.

 

PHỤ LỤC C

(Quy định)

Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa

C.1. Kiểm tra đặc tính sinh H2S

C.1.1. Môi trường

Chuẩn bị môi trường TSI hay Kligler(theo hướng dẫn của nhà sản xuất)

Thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI. Thạch màu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucoza, sinh hơi, sinh H₂S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactoza.

C.1.2. Cách tiến hành

Dùng que cấy chích sâu (4.7) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đúng) xuống đáy ống nghiệm chứa môi trường TSI hay Kligler (xem C.1.1), rút dần que cấy lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), kiểm tra sau 24 h đến 48 h.

C.1.3. Đọc kết quả

- Dương tính: đáy ống nghiệm có màu đen;

- Âm tính: đáy ống nghiệm không có màu đen.

C.2. Kiểm tra khả năng phân hủy arginin

C.2.1. Môi trường

Thành phần:

Peptone	4g
L - arginine	0,5 g
Glucose	0,1 g
Chỉ thị màu Bromocresol purple	0,1 ml
Nước	100 ml
Chỉnh pH đến 6,0
Dung dịch chỉ thị màu Bromocresol purple
Bromocresol purple	1,5 g
Cồn 90%	100 ml

C.2.2. Tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào môi trường có chứa arginin và chỉ thị màu, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), kiểm tra sau 24 h đến 48 h.

C.2.3. Đọc kết quả

- Dương tính: môi trường chuyển màu tím;

- Âm tính: môi trường có màu vàng (không chuyển màu).

Nếu sử dụng môi trường thương mại thì pha chế và đọc kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.3. Phản ứng Catalaza

Nhỏ một giọt dung dịch H₂O₂ 3 % lên phiến kính (xem 4.4).

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào giọt dung dịch H₂O₂ 3 %.

Đọc kết quả sau 5 s như sau:

- Dương tính: có hiện tượng sủi bọt;

- Âm tính: không có hiện tượng sủi bọt.

C.4. Phản ứng Oxidaza

Tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride.

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên mặt giấy đã thấm thuốc thử.

Đọc kết quả sau 30 s như sau:

- Dương tính: tại chỗ phết khuẩn lạc có xuất hiện màu tím;

- Âm tính: không xuất hiện màu tím.

C.5. Phản ứng đỏ methyl (Phản ứng MR - Methyl Red)

C.5.1. Môi trường

- Chuẩn bị môi trường VP - MR (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

- Chuẩn bị dung dịch đỏ methyl trong cồn 95 %:

Đỏ methyl	0,04 g
Cồn 95 %	60 ml
Nước	40 ml

C.5.2. Tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào môi trường VP - MR, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h nhỏ vào môi trường nuôi cấy 5 giọt dung dịch đỏ methyl trong cồn 95 %. Đọc kết quả sau 5 min.

C.5.3. Đọc kết quả

- Dương tính: môi trường có màu đỏ;

- Âm tính: môi trường có màu vàng.

C.6. Kiểm tra đặc tính di động

Kiểm tra đặc tính di động của vi khuẩn có thể dùng phương pháp giọt treo dưới kính hiển vi (xem 4.2) hoặc cấy vi khuẩn vào môi trường thạch lỏng (semi-solid).

Phương pháp giọt treo dưới kính hiển vi:

Dùng phiến kính (xem 4.4) đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.

Cho một giọt canh khuẩn lên giữa kính phủ vật. Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh khuẩn quay xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính.

Chú ý không giọt canh khuẩn lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm.

Đặt tiêu bản lên kính hiển vi (xem 4.2) và quan sát ở vật kính độ phóng đại 10 lần hoặc 40 lần.

Trên thị trường hiện nay đã xuất hiện một dụng cụ có tên gọi là vòng O (O-ring) dùng để thực hiện giọt treo mà không cần lam kính lõm. Đây là một miếng đệm hình tròn, có kích thước vòng trong 12 mm, cao 3 mm có thể sử dụng nhiều lần. Khi thực hiện, đặt vòng O lên giữa lam kính thường, đưa giọt canh khuẩn vào một mặt của kính phủ vật, xoay ngược kính phủ vật và úp lên vòng O.

Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn bằng môi trường thạch lỏng:

Chuẩn bị môi trường: Môi trường thạch lỏng (từ 0,2 % đến 0,5 % thạch) đựng trong ống nghiệm (xem 4.6).

Cách tiến hành: Dùng que cấy chích sâu (xem 4.7) lấy khuẩn lạc rồi cấy chích sâu vào ống chứa môi trường thạch lỏng trên, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h đọc kết quả.

- Khả năng di động dương tính: Vi khuẩn mọc lan ra xung quanh đường cấy chích sâu.

- Khả năng di động âm tính: Vi khuẩn chỉ mọc theo đường cấy chích sâu.

 

PHỤ LỤC D

(Quy định)

Phát hiện vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR

D.1. Nguyên liệu PCR

D.1.1. Taq PCR Master Mix Kit

D.1.2. Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2)

D.1.3. Nước tinh khiết không có nuclease

D1.4. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

D.1.5. Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

D.1.6. Loading dye

D.1.7. DNA chuẩn (Ladder, marker)

D.2. Chuẩn bị mẫu

Mẫu vi khuẩn kiểm tra là vi khuẩn nghi ngờ là E. rhusiopathiae đã nuôi cấy thuần khiết trên môi trường thạch máu (xem 3.2) trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1) từ 24 h đến 48 h.

Mẫu vi khuẩn làm đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được giám định là E. rhusiopathiae hoặc sử dụng các chủng E. rhusiopathiae chuẩn.

D.3. Tách chiết DNA

Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại hoặc bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Dùng que cấy (xem 4.5) lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 nl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

D.4. Phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn E. rhusiopathiae

Sử dụng cặp mồi ở Bảng 2 và chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau:

	- Taq PCR Master Mix Kit	12,5 μl
	- Mồi xuôi 20 μM	1 μl
	- Mồi ngược 20 μM	1 μl
	- Nước không có nuclease	8,5 μl
	- Mẫu DNA	2 μl
	Tổng thể tích	25 μl

Chu trình nhiệt trong Bảng 2.

Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn E. rhusiopathiae (xem D.2).

Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA của vi khuẩn.

D.5. Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch.

Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian 30 min đến 40 min, ở 100 V.

Sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidi bromua 0,2 mg /100 ml.

Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).

D.6. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra không có vạch giống mẫu đối chứng dương.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] JICA. Third edition, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. p.110 - 111.

[2] J.Quinn, M.E.Carter, B.Markey, G.R.Carter, 2004. Veterinary Clinical Microbiology. 6th Edition. Printed in Spain, p.191 -208.

[3] G.l. Barrow, R.K.A. Feltham. Cowan and Steel's. Mannual for the identification of media bacteria. Third edition, 1993.

[4] Richard L.Wood, Louis M.Henderson, 2006. Chapter 37: Erysipelas. Diseases of Swine. 9th Edition. Blackwell Publishing, p.646-655.

[5] Yoshihiro Shimoji, Yasuyuki Mori, Koji Hyakutake, Tsutomu Sekizaki, Yuichi Vokomizo, 1998. Use of an Enrichment Broth Cultivation-PCR Combination Assay for Rapid Diagnosis of Swine Erysipelas. J Clin Microbiol, 36(1): 86-89.

[6] G.M.Cross and G.J.Eamens, 1993. Erysipelothrix rhusiopathiae infection. Australian Standard diagnostic techniques for animal diseases.

[7] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y.