Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-25:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-25:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 25: Bệnh cúm lợn được xây dựng nhằm cung cấp một quy trình chuẩn hóa, khoa học và thống nhất trên phạm vi cả nước để chẩn đoán chính xác, nhanh chóng bệnh cúm lợn. Tiêu chuẩn này do Viện Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định và Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

- Phạm vi áp dụng và tài liệu viện dẫn (Điều 1 và Điều 2)

• Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định chi tiết quy trình chẩn đoán lâm sàng, bệnh tích và các xét nghiệm phòng thí nghiệm đối với bệnh cúm lợn (Swine Influenza) do virus cúm type A gây ra. Tiêu chuẩn áp dụng cho tất cả các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm dịch động vật, cơ sở thú y và các tổ chức, cá nhân thực hiện công tác chẩn đoán, giám sát dịch bệnh trên đàn lợn tại Việt Nam.
• Tài liệu viện dẫn: Việc áp dụng tiêu chuẩn này cần phối hợp chặt chẽ với các tài liệu viện dẫn hiện hành về quy trình lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm động vật do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành nhằm đảm bảo chất lượng mẫu thử đầu vào.

- Thuật ngữ, định nghĩa và đặc điểm dịch tễ (Điều 3)

• Định nghĩa bệnh: Bệnh cúm lợn là một bệnh truyền nhiễm cấp tính đường hô hấp ở lợn, gây ra bởi virus cúm Influenza type A thuộc họ Orthomyxoviridae. Các phân týp virus cúm lợn phổ biến nhất hiện nay bao gồm H1N1, H1N2 và H3N2.
• Đặc điểm dịch tễ: Bệnh có khả năng lây lan rất nhanh trong đàn thông qua đường hô hấp (tiếp xúc trực tiếp, giọt bắn, không khí). Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh trong đàn có thể lên tới 100%, nhưng tỷ lệ tử vong thường thấp (chỉ từ 1% đến 4%), trừ trường hợp có sự ghép bệnh hoặc kế phát với các tác nhân gây bệnh đường hô hấp khác như Mycoplasma, Pasteurella, hoặc PRRS (tai xanh).

- Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và nguyên liệu (Điều 4)

Để thực hiện quy trình chẩn đoán bệnh cúm lợn theo tiêu chuẩn, phòng thí nghiệm cần được trang bị đầy đủ các thiết bị và hóa chất chuyên dụng sau:

• Thiết bị và dụng cụ: Tủ an toàn sinh học cấp 2; máy nhân gen PCR hoặc Real-time PCR; máy ly tâm lạnh chuyên dụng; tủ lạnh sâu (từ -20 độ C đến -80 độ C); kính hiển vi quang học; bộ pipet tự động các thể tích; các loại ống nghiệm, đĩa thạch và dụng cụ tiêu hao vô trùng.
• Hóa chất và sinh phẩm: Kít tách chiết RNA virus; kít RT-PCR hoặc Real-time RT-PCR một bước (One-step RT-PCR); các cặp mồi (primers) và mẫu dò (probes) đặc hiệu để phát hiện gen Matrix (M) của virus cúm A và các phân týp H1, H3, N1, N2; nước cất không có nuclease; kháng nguyên và kháng thể chuẩn phục vụ cho các phản ứng huyết thanh học.

- Quy trình chẩn đoán lâm sàng và bệnh tích đại thể

Chẩn đoán lâm sàng và quan sát bệnh tích là bước sơ bộ quan trọng để định hướng xét nghiệm khẳng định:

• Triệu chứng lâm sàng: Lợn mắc bệnh thường sốt cao đột ngột (từ 40,5 độ C đến 41,5 độ C), nằm tụm một chỗ, ủ rũ, mệt mỏi, giảm ăn hoặc bỏ ăn hoàn toàn. Xuất hiện các triệu chứng đường hô hấp rõ rệt như ho sặc sụa, hắt hơi, chảy nhiều nước mũi (ban đầu trong, sau đó đặc hoặc có mủ), thở khó, thở thể bụng (thở giật). Lợn sụt cân nhanh chóng và da có thể bị sung huyết đỏ ở một số vùng.
• Bệnh tích đại thể: Tổn thương đặc trưng tập trung ở cơ quan hô hấp. Phổi bị viêm thùy đối xứng, chủ yếu ở thùy đỉnh, thùy tim và thùy hoành. Vùng phổi bị tổn thương có màu đỏ sẫm đến tím xám, sờ vào thấy chắc đặc như thịt (gan hóa). Khí quản và phế quản chứa nhiều dịch nhầy, bọt khí. Hạch lâm ba phổi sưng to, sung huyết và chứa nhiều dịch.

- Quy trình chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Để đưa ra kết luận chính xác nhất, tiêu chuẩn quy định thực hiện các phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử và huyết thanh học:

• Lấy mẫu và xử lý bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm sống là tăm bông ngoáy dịch mũi (nasal swabs) thu thập từ lợn ở giai đoạn sốt cấp tính. Mẫu bệnh phẩm từ lợn chết gồm phổi (vùng ranh giới giữa phần tổn thương và phần lành), hạch phổi. Mẫu phải được bảo quản trong môi trường vận chuyển chuyên dụng, giữ lạnh ở nhiệt độ từ 2 độ C đến 8 độ C và chuyển ngay về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. Nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ -70 độ C hoặc thấp hơn.
• Phương pháp RT-PCR và Real-time RT-PCR: Đây là phương pháp chẩn đoán xác định có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất. Quy trình bao gồm các bước tách chiết RNA của virus, thực hiện phản ứng khuếch đại gen với các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện gen M (khẳng định sự hiện diện của virus cúm A) và tiếp tục định týp kháng nguyên (H1, H3, N1, N2) để xác định chủng virus gây bệnh.
• Phân lập virus (nếu cần): Tiêm truyền dịch chiết bệnh phẩm đã xử lý kháng sinh vào túi niệu của trứng gà ấp có phôi từ 9 ngày đến 11 ngày tuổi, hoặc nuôi cấy trên dòng tế bào MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Thu hoạch dịch nổi để kiểm tra hoạt tính ngưng kết hồng cầu (HA) và xác định virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).
• Chẩn đoán huyết thanh học: Sử dụng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) hoặc kỹ thuật ELISA để phát hiện và giám sát kháng thể kháng virus cúm lợn trong các mẫu huyết thanh kép (lấy cách nhau từ 14 đến 21 ngày) nhằm đánh giá sự chuyển đổi huyết thanh trong đàn.