TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8400-16:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 16: BỆNH PHÙ Ở LỢN DO VI KHUẨN E. COLI

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 16: Edema disease in pig

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh phù trên lợn (bệnh phù đầu) do vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) gây ra.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh phù ở lợn (edema disease in pig)

Bệnh do vi khuẩn E. coli có yếu tố bám dính Fimbriae 18 (F18) và có khả năng sản sinh độc tố Verotoxin 2e (VT2e) gây ra.

CHÚ THÍCH: Bệnh thường xảy ra vào giai đoạn cai sữa, khi thay đổi chế độ dinh dưỡng. Trong ruột non, những chủng E. coli có nhân tố bám dính F18 nhân lên nhanh chóng, bám vào thành ruột và sản sinh độc tố VT2e. Độc tố được hấp thu vào máu, tác động vào các tế bào biểu mô của các vi mạch quản làm tăng tính thẩm thấu qua thành mạch gây ra phù và các triệu chứng thần kinh điển hình như: đi lại loạng choạng, xiêu vẹo, co giật hay liệt.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ có quy định khác.

- Cồn etanol 70 %, 90 %.

- Thuốc thử Kovac’s.

- Máu bò, bê hoặc cừu.

- Môi trường (brain heart infusion ) BHI.

- Môi trường (Typtone Soy Broth) TSB.

- Thạch MacConkey hay thạch Brilliant green.

- Môi trường thạch nghiêng Kligler hay thạch Triple sugar iron (TSI).

- Maltose.

- Urê.

- Môi trường nước pepton.

- Môi trường Voges- Proskauer (VP).

- Etanol (C2H6O).

- Nguyên liệu cho PCR.

- Agarose.

- Etidi bromua (EtBr).

- Dung dịch TAE hoặc TBE.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 oC.

- Buồng cấy.

- Tủ lạnh.

- Que cấy.

- Đĩa Petri để đổ môi trường.

- Panh.

- Kéo.

- Nồi hấp ướt (Autoclave).

- Tủ sấy khô.

- Lò vi sóng.

- Cân điện.

- Kính hiển vi.

- Pipet thủy tinh.

- Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml.

5. Cách tiến hành

5.1 Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1 Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh thường xuất hiện ở lợn con sau khi cai sữa đôi khi ở nái.

- Bệnh xuất hiện lẻ tẻ, ít lây lan từ đàn này sang đàn khác

- Lợn bị bệnh thường là những con phát triển nhanh nhất trong đàn.

- Tỉ lệ chết khoảng 65 % đến 90 %.

5.1.2 Triệu chứng lâm sàng

- Một hoặc nhiều lợn bị chết đột ngột mà không biểu hiện triệu chứng lâm sàng.

- Có biểu hiện rối loạn thần kinh bao gồm: đi lại loạng choạng, xiêu vẹo, co giật hay bị liệt. 

- Phù ở mí mắt, ở mặt, phần bụng phù và sưng to.

- Thở khó, kêu khàn khàn do thanh quản bị phù. 

- Bỏ ăn, bỏ bú.

- Lợn thường chết trong vòng từ 4 h đến 48 h sau khi có triệu chứng lâm sàng.

5.1.3 Bệnh tích đại thể

- Phù dưới da toàn thân.

- Phù ở mí mắt, kết mạc, đường cong lớn dạ dày.

- Có dịch nhầy ở dưới niêm mạc dạ dày.

- Tràn dịch màng tim, màng phổi, xoang bụng tích nước.

5.1.4 Lấy mẫu

Bệnh phẩm gồm: ruột non (phần hồi tràng), ruột kết

Lấy vô trùng khoảng 50 g đến 100 g mỗi loại bệnh phẩm, cho vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 oC đến 8 oC và gửi về phòng thí nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu.

Gửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ.

5.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.2.1 Phân lập vi khuẩn

Lấy một vòng que cấy chất chứa của ruột (dịch nhày của niêm mạc ruột), tại ba vị trí khác nhau, cấy vào môi trường thạch máu và thạch MacConkey hoặc thạch Brilliant green. Nuôi cấy ở 37 oC trong điều kiện hiếu khí từ 18 h đến 24 h.

Trên môi trường thạch MacConkey khuẩn lạc E. coli có dạng tròn màu hồng đậm, nhám hoặc trơn đường kính 2 - 4 mm.

Trên môi trường thạch Brilliant green khuẩn lạc E. coli có dạng tròn màu vàng chanh. 

Trên Thạch máu: Khuẩn lạc màu trắng xám, tròn, bóng và thường gây dung huyết.

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường thạch thường hay nước thịt BHI hoặc môi trường TSB để kiểm tra đặc tính sinh hóa và giám định độc lực.

5.2.2 Giám định vi khuẩn

5.2.2.1 Giám định đặc tính sinh hóa

Có thể dựa vào một số đặc tính sinh hóa quy định tại Bảng 1 hoặc Bảng 2 để xác định vi khuẩn E. coli. 

Bảng 1 - Đặc tính sinh hóa của E. coli

Vi khuẩn	Lactose	Indol	Urê	Sucrose	H2S	Manitol
E. coli	+	+	-	+	-	+

- Xác định đặc tính lên men đường sucrose, lactose, sinh H2S theo quy định tại Phụ lục A. 

- Xác định đặc tính lên men đường manitol theo quy định tại Phụ lục A. 

- Khả năng phân giải ure theo quy định tại Phụ lục A.

Bảng 2: Đặc tính sinh hóa của E. coli (ph n ng IMViC)

Vi khuẩn	Sinh indol (I)	Đỏ metyl (M)	Voges-Proskauer (V)	Khả năng sử dụng xitrat (C)
E. coli	+	+	-	-

Xác định đặc tính sinh hóa theo quy định tại Phụ lục A.

5.2.3 Xác định gene quy định yếu tố độc lực F18 và VT2e

Sử dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) với các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện genemã hóa cho yếu tố bám dính F18 và toxin VT2e như trong Bảng 3.

Bảng 3 - Các cặp mồi và chu trình nhiệt cho PCR

Gene đích	Kí hiệu	Sequence (5′-3′)	Kích cỡ sản phẩm (bp)	Chu trình nhiệt
F18	Fed A1	GTGAAAAGACTAGTGTTTATTTC	510	94oC, 5 min ;
	FedA2	CTTGTAAGTAACCGCGTAAGC		Chu trình 30 vòng:
VT2e a)	VTe-a	CCTTAACTAAAAGGAATATA	230	(94oC, 1 min;
	VTe-b	CTGGTGGTGTATGATTAATA		55oC, 1 min;
VT2e a)	STII-Bv1	ATGAAGAAGATGTTTATAGCG	260	72oC, 1 min)
	STII-Bv2	GTTAAACTTCACCTGGGCAAAG		72oC, 7 min. Giữ: 4oC
a) Để phát hiện gene VT2e, có thể sử dụng một trong hai cặp mồi này.

Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục B.

6. Kết luận

Lợn được xác định là mắc bệnh phù (phù đầu) khi:

Có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và phân lập được vi khuẩn

E. coli mang yếu tố độc lực F18 và VT2e.

 

PHỤ LỤC A

(Quy định)

MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA

A.1 Đặc tính lên men đường sucrose, lactose, manitol, sinh H2S và phân giải ure

A.1.1 Lên men đường sucrose, lactose, sinh H2S

A.1.1.1 Môi trường

Chuẩn bị môi trường TSI hay Kligler (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

Thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI. Thạch màu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucoza, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactoza.

A.1.1.2 Tiến hành

Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi cấy ở 37 oC trong điều kiện hiếu khí, sau 24 h kiểm tra.

A.1.1.3 Đọc kết quả

Lên men đường lactoza:

- Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng;

- Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng.

Lên men đường glucose:

- Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng;

- Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng.

Khả năng sinh H2S:

- Dương tính: đáy ống nghiệm có màu đen;

- Âm tính: đáy ống nghiệm không có màu đen.

Khả năng sinh hơi:

- Dương tính: Thạch trong ống nghiệm bị nứt hay có bọt khí;

- Âm tính: Thạch trong ống nghiệm không bị nứt hay có bọt khí.

A.1.2 Lên men đường manitol

A.1.2.1 Chuẩn bị môi trường

Pha nước pepton theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Chuẩn bị chỉ thị màu Andrade

Thành phần:

Fuchsin axit                                                           0, 5 g

Nước                                                                     100 ml

NaOH 1 N

Cách pha: Nghiền fuchsin, hoà vào nước cho tan hết. Cho từ từ lượng dung dịch NaOH 1 N, vừa cho vừa lắc đến khi chuyển màu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì dừng (thường từ 12 ml đến 17 ml). Để lắng từ 1 h đến 2 h, lọc qua giấy lọc. Hấp 120 oC trong 15 min.

Cho 1 ml chỉ thị màu Andrade vào 100 ml môi trường nước pepton, chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp 120 0C trong 30 min.

Chuẩn bị đường: pha đường thành dung dịch 10 % (trong nuước cất) hấp 110 0C trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần 100 oC trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Cho đường vào các ống môi trường: cho 0,3 ml dung dịch đường 10 % vào ống chứa 4 ml môi trường.

A.1.2.2 Phương pháp kiểm tra và đọc kết quả

Cấy vi khuẩn đã nuôi cấy thuần khiết vào các ống môi trường nước pepton có đường, để vào tủ ấm 37 oC, sau 24 h đọc kết quả.

- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ.

A.1.3 Phân giải urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (Urea agar base - Christensen) chế môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Cấy vi khuẩn vào môi trường có urê, nuôi cấy ở 37oC, đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu tím.

A.2 Các phản ứng IMViC

A.2.1 Phản ứng sinh indol

Thành phần thuốc thử Kovac’s

Paradimetylaminobenzaldehyde                   5 g

Amyl alcohol (cồn amyl)                                75 ml

HCl đặc                                                          25 ml

Cách pha: cho Paradimetylaminobenzaldehyde vào cồn để vào nước ấm 50 đến 55 oC, lắc đều cho tan, để nguội hoàn toàn, hay lạnh (4 oC), cho từ từ HCl đặc, vừa cho vừa lắc.

Bảo quản thuốc thử ở nhiệt độ lạnh khoảng 4 oC trong lọ màu.

Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton hoặc môi trường nước pepton có bổ sung tryptophan, ủ ở 37 oC. Sau 24 h, nhỏ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ.

- Phản ứng dương tính: trên bề mặt môi trường vòng thuốc thử chuyển màu đỏ.

- Phản ứng âm tính: vòng thuốc thử không chuyển màu

A.2.2 Phản ứng MR

Thuốc thử phản ứng MR

Đỏ metyl                                                         0,04 g

Cồn 95 độ                                                      60 ml

Nước                                                              40 ml

Môi trường VP-MR pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Cấy vi khuẩn vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 37oC sau 24 h nhỏ vào môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn mẫu 5 giọt dung dịch thuốc thử, đọc kết quả sau 5 min.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ

- Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng.

A.2.3 Phản ứng VP

Pha môi trường VP-MR: Theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Pha thuốc thử

- Dung dịch 1:

Alpha naphthol (C10H7OH)                                       5 g

Cồn 96 %                                                                100 ml

- Dung dịch 2:

KOH                                                                        40 g

Nước                                                                       100 ml

Tiến hành phản ứng: Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường VP-MR, nuôi cấy ở 37 oC, sau 48 h nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Đọc kết quả sau 15 min và 1 h.

- Phản ứng dương tính: Môi trường có màu đỏ hồng đậm.

- Phản ứng âm tính: Môi trường có màu vàng hoặc không biến màu.

A.2.4 Sử dụng xitrat

Pha chế môi trường (thạch simon xitrat) theo quy định của nhà sản xuất. Cấy vi khuẩn vào thạch simon xitrat nuôi ở 37 0C từ 18 h đến 24 h. Vi khuẩn sử dụng xitrat (dương tính) làm môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển. Âm tính khi môi trường giữ nguyên màu xanh lá cây.

 

PHỤ LỤC B

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP PCR GIÁM ĐỊNH GENE QUY ĐỊNH YẾU TỐ ĐỘC LỰC F18 VÀ VT2E

B.1 Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra có thể là khuẩn lạc hay canh khuẩn nuôi cấy từ 18 h đến 24 h. Hòa khuẩn lạc nghi ngờ trực tiến vào hỗn hợp phản ứng PCR hoặc cho 2 µl nước canh khuẩn.

Mẫu đối chứng dương: Chủng vi khuẩn E. coli đã biết có mang gene F18 và VT2e.

Mẫu có thể là DNA tách chiết từ khuẩn lạc hay canh trùng nuôi cấy. Có thể tách chiết DNA bằng các kit thương mại hay bằng nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết bằng phương pháp shock nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc hòa vào 100 l nước vô trùng không chứa men Rnase và Dnase (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min, rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch 12000 r/min trong 5 min. Thu hoạch nước trong để làm phản ứng PCR.

B.2 Tiến hành phản ứng PCR

Có thể dùng các kit PCR thương mại và sử dụng kết hợp với hướng dẫn của nhà sản xuất.

Nếu sử dụng Taq DNA polymerase của hãng QIAGEN thì thành phần cho 1 phản ứng PCR với tổng thể tích là 50 ml bao gồm: 10X coral bufer: 5 ml; 200 mM mỗi loại dNTP; Taq DNA polymerase 2,5 UI; primer forward và primer reverse 1 mM mỗi loại; nước cất tiệt trùng; DNA tách chiết từ mẫu (2 ml) hoặc khuẩn lạc hay canh trùng vi khuẩn.

Đối chứng dương: Vi khuẩn hay DNA tách chiết từ vi khuẩn E. coli đã biết có mang gene F18 và VT2e.

Đối chứng âm: bao gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA tách chiết từ mẫu hay vi khuẩn.

B.3 Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 ml dung dịch loading dye vào 8 ml sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 ml thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidi bromua 0,2 mg/100ml.

Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (ví dụ như SYBR safe DNA gel stain của hãng Invitrogen) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

B.4 Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.