TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-11: 2019

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 11: BỆNH DỊCH TẢ VỊT

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 11: Duck virus enteritis disease

Lời nói đầu

TCVN 8400-11: 2019 thay thế TCVN 8400-11:2011

TCVN 8400-11: 2019 do Chi cục Thú y vùng VI - Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của Tổ chức Thú y thế giới (OIE) và các bài báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần:

- TCVN 8400-1: 2019, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2: 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3: 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4: 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

- TCVN 8400-5: 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6: 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7: 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8: 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9: 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10: 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11: 2019, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12: 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13: 2019, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-14: 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15: 2019, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16: 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

- TCVN 8400-17: 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18: 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19: 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20: 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21: 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22: 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23: 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24: 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25: 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26: 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27: 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28: 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29: 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30: 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31: 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32: 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33: 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34: 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35: 2015, phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36: 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

- TCVN 8400-37: 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38: 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus;

- TCVN 8400-39: 2016, phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40: 2016, phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestiter gây ra.

- TCVN 8400-41: 2019, phần 41: Bệnh dịch tả lợn Châu Phi.

- TCVN 8400-42: 2019, phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

- TCVN 8400-43: 2019, phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44: 2019, phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45: 2019, phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46: 2019, phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47: 2019, phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

 

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 11: BỆNH DỊCH TẢ VỊT

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 11: Duck virus enteritis disease

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả vịt ở thủy cầm trong phòng xét nghiệm.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8402:2010 Bệnh động vật - Quy trình mổ khám.

3  Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

3.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh dịch tả vịt (Duck virus enteritis disease)

Bệnh dịch tả vịt (DVE) là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây tử vong cao cho vịt, ngỗng và thiên nga (gọi chung là thủy cầm) do một vi rút thuộc nhóm Herpesvirus, họ Alpha herpesviridae, có cấu trúc ADN gây ra.

3.2  Từ viết tắt

- DVE (Duck Virus Enteritis Disease): Bệnh dịch tả vịt;

- PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp;

- PBS (Phosphate buffered saline): dung dịch muối đệm phốt phát;

- VNT (Virus Neutralization Test): Phản ứng trung hòa vi rút;

- CPE (Cytopathic pathogene effect): Bệnh tích tế bào;

- ARN: Axít ribonucleic;

- ADN: Axít deoxyribonucleic;

- SN (Serum Neutralization): Phản ứng trung hòa huyết thanh với vi rút giống chuẩn;

- FBS (Fetal Bovine Serum): Huyết thanh bào thai bê;

- DEF (Duck Embryo Fibroblast): Tế bào xơ phôi vịt;

- NI (Neutralization Index): Chỉ số trung hòa;

- Ct (Cycle threshold): Chu kỳ ngưỡng;

- EID₅₀ (Embryo Infective Dosage, 50%): Liều gây nhiễm 50% phôi trứng;

- ELD₅₀ (Embryo Lethal Dosage, 50%): Liều gây chết 50% phôi trứng;

- TCID₅₀ (Tissue Culture Infective Dosage, 50%): Liều gây nhiễm 50% tế bào.

4  Thuốc thử, vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, không có DNAse và RNAse, trừ khi có quy định khác.

4.1  Thuốc thử và vật liệu dùng cho lấy mẫu

4.1.1  Cồn (Ethanol), từ 70 % đến 100 %;

4.1.2  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem Phụ lục A);

4.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR/ realtime PCR

4.2.1  Kít chiết tách AND/ARN vi rút;

4.2.2  Bộ kít nhân gen;

4.2.3  Mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò;

4.2.4  Mẫu chuẩn dương, được chứng nhận là dương tính hoặc ADN chuẩn dương tách chiết từ vi rút DVE có giá trị Ct đã biết trước;

4.2.5  Nước tinh khiết, không có DNAse/RNAse

4.2.6  Bột agarose, dung dịch Tris-borate-EDTA (TBE) 10X

4.2.7  GelRed Nucleic Acid stain;

4.2.8  Loading dye;

4.2.9  Thang chuẩn DNA 100bp.

4.3  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phân lập

4.3.1  Phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi;

4.3.2  Giống vi rút Dịch tả vịt;

4.3.4  Kháng huyết thanh chuẩn kháng vi rút Dịch tả vịt;

4.3.5  Môi trường tế bào MEM (Minimum Essential Medium).

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

5.1.1  Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0 °C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

5.1.2  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

5.1.3  Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

5.1.4  Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, vô trùng;

5.1.5  Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

5.2  Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp PCR/realtime PCR

5.2.1  Máy PCR, realtime PCR;

5.2.2  Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có);

5.2.3  Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

5.2.4  Máy lắc ủ nhiệt;

5.2.5  Máy spindown, máy ly tâm lắng;

5.2.6  Bồn điện di;

5.2.7  Máy đọc gel.

5.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên môi trường tế bào

5.3.1  Đĩa nuôi tế bào (6 giếng, 24 giếng, 96 giếng);

5.3.2  Lọ nuôi tế bào (T25, T75);

5.3.3  Tủ ấm, có chứa 5 % CO₂, duy trì được ở 37 °C;

5.3.4  Tủ ấp trứng;

5.3.5  Đèn soi trứng;

5.3.6  Buồng đếm tế bào Neubauer;

5.3.7  Kính hiển vi soi ngược;

5.3.8  Máy lắc đĩa (orbital shaker);

Ngoài ra, còn có các loại đầu típ, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Dịch tễ học

Bệnh dịch tả vịt xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1923 tại Hà Lan ở một đàn vịt nhà với triệu chứng ủ rũ, khát nước và chết sau 1 ngày. Năm 1949, bệnh được đặt tên là Duck virus enteritis - DVE.

Bệnh lây lan cho vịt, ngan, ngỗng ở mọi lứa tuổi, từ 7 ngày tuổi đến khi trưởng thành. Ở những đàn nhạy cảm, bệnh lây lan nhanh và trầm trọng với dấu hiệu tử vong cao, đột ngột (xảy ra từ 1 ngày đến 5 ngày sau khi bắt đầu có triệu chứng lâm sàng) và dai dẳng, sụt giảm đáng kể trứng trong những đàn lấy trứng. Tỷ lệ chết có thể từ 70 % đến 80 % nếu bị nhiễm lần đầu ở trại không tiêm phòng vắc xin dịch tả vịt thường xuyên, kết hợp với vệ sinh không đảm bảo.

Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp giữa các vịt khỏe mạnh và vịt bị nhiễm bệnh. Bệnh truyền qua phân thủy cầm mắc bệnh và các dịch tiết từ mũi, miệng và mắt. Bệnh lây lan nhanh và có thể lây lan dễ dàng bằng phương tiện cơ học như giày dép và quần áo mang từ một đàn bị nhiễm đến.

6.2  Triệu chứng lâm sàng

Thời gian ủ bệnh thường từ 3 ngày đến 7 ngày tùy theo độc lực của vi rút.

Triệu chứng đặc trưng là sốt cao, sưng phù đầu, mù mắt, tiêu chảy phân trắng xanh, biểu hiện thần kinh quẹo đầu.

Vịt, ngan, ngỗng bị bệnh có hiện tượng giảm ăn, mất thăng bằng, phân loãng, xù lông, chảy nước mũi, mắt có dử, mí mắt sưng. Con vật sợ ánh sáng.

6.3  Bệnh tích

Tùy theo trường hợp có thể thấy một hoặc nhiều trong những bệnh tích sau:

Ở vịt trưởng thành có hiện tượng gan bị bạc màu hoặc xuất huyết điểm. Vịt cái có thể thấy các nang trứng bị xuất huyết.

Mạch máu bị tổn thương. Hệ bạch huyết bị tổn thương và thoái hóa nhu mô.

Đường tiêu hóa bị viêm, ruột xuất huyết thành từng mảng, có nhiều chất nhờn. Đây là bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả vịt.

Kiểm tra vi thể thấy tổn thương mạch máu và các cơ quan phủ tạng. Xuất hiện các thể vùi nội nhân, thể vùi tế bào chất trong các tế bào biểu mô của hệ thống tiêu hóa. Đây là biến đổi vi thể điển hình của bệnh.

7  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1  Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

7.1.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo hướng dẫn của quy trình mổ khám TCVN 8402:2010.

Mẫu được lấy vào thời kỳ đầu của ổ dịch, mẫu lấy ngay sau khi con vật ốm, chết hoặc mổ khám.

Mẫu bệnh phẩm là gan, lách, thận. Nếu là con vật bệnh hoặc xác mới chết phải lấy từ 3 con đến 5 con. Bệnh phẩm là huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt, huyết thanh được lấy sau 10 ngày từ khi dịch bệnh xảy ra, hoặc nếu vịt đã tiêm phòng thì lấy sau khi tiêm 1 tháng để kiểm tra kháng thể bảo hộ.

Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đông băng từ âm 20 °C đến âm 80 °C. Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C tối đa trong 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ âm 20 °C (đối với mẫu huyết thanh) và ở âm 80 °C (đối với mẫu bệnh phẩm phát hiện vi rút).

7.1.2  Xử lý mẫu bệnh phẩm

Tạo huyễn dịch 10% từ mẫu bệnh phẩm (gan, lách, thận) trong dung dịch PBS (4.1.2) vô trùng (ví dụ: nghiền 1 g mẫu bệnh phẩm trong 9 ml dung dịch PBS). Sau đó ly tâm huyễn dịch 2500 g trong 15 phút bằng máy ly tâm (5.2.3). Thu dịch nổi để chẩn đoán phát hiện vi rút dịch tả vịt bằng phản ứng realtime PCR, PCR hoặc phân lập vi rút.

Bệnh phẩm là máu được giữ ở 4 °C đến 8 °C chờ đông rồi tách lấy huyết thanh để chẩn đoán phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt.

7.2  Phát hiện kháng nguyên

7.2.1  Phân lập và giám định vi rút dịch tả vịt trên phôi trứng vịt

Sử dụng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi để tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý (7.1.2). Thu hoạch dịch niệu mô để giám định vi rút bằng phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn trên phôi trứng vịt (xem Phụ lục B) hoặc bằng phương pháp realtime PCR hoặc PCR (7.2.3).

7.2.2  Phân lập và giám định vi rút dịch tả vịt trên tế bào xơ phôi vịt

Sử dụng tế bào xơ phôi vịt (DEF) để gây nhiễm bằng huyễn dịch bệnh phẩm. Thu hoạch dịch nuôi tế bào và giám định vi rút bằng phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn trên môi trường tế bào DEF (xem Phụ lục C).

7.2.3  Phương pháp realtime PCR và PCR

7.2.3.1  Chiết tách ADN

- Tiến hành chiết tách ADN từ các mẫu đã được xử lý (7.1.2). Ví dụ sử dụng kít chiết tách InviMAG virus DNA/RNA Mini Kit/KF96 1), hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách DNA vi rút (tham khảo Phụ lục D).

- Mẫu ADN vi rút sau khi chiết tách được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

7.2.3.2  Phương pháp realtime PCR

- Sử dụng cặp mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò (tham khảo Bảng E.1, Phụ lục E) với nồng độ thích hợp (mồi ở nồng độ 20 µM, đoạn dò ở nồng độ 5 µM) và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Platinum^® Quantitative PCR SuperMix - UDG 2), Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen (nếu áp dụng kít khác có thể thay đổi thành phần Master mix cho phù hợp với tên trong Bảng E.2, Phụ lục E).

- Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng (tham khảo Bảng E.2, Phụ lục E).

- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi rút DVE có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương.

+ Cho 5 µl nước tinh khiết, không có nuclease vào ống PCR đối chứng âm

+ Cho 5 µl ADN của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR

+ Đặt ống PCR vào máy realtime PCR.

CHÚ THÍCH:

1) Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

2) Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị.

- Chu trình nhiệt chạy phản ứng tham khảo Bảng E.3, Phụ lục E.

- Kết quả của phản ứng realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.

- Đánh giá kết quả:

+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40

+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.

- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh dịch tả vịt khi kết quả realtime PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

7.2.3.3  Phương pháp PCR

- Chuẩn bị mồi cho phản ứng PCR: Trình tự mồi phát hiện vi rút dịch tả vịt (tham khảo Bảng F.1, Phụ lục F).

CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi cần tham khảo khuyến cáo của OIE cập nhật mới để lựa chọn mồi phù hợp.

- Sử dụng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Hot Start Taq Gold DNA polymerase 3) với nồng độ và thể tích tham khảo Bảng F.2, Phụ lục F.

- Tiến hành phản ứng PCR (tham khảo Phụ lục F).

7.3  Phát hiện kháng thể

Phát hiện kháng thể vi rút dịch tả vịt trong huyết thanh vịt mắc bệnh hoặc đã được tiêm phòng vắc xin bằng phương pháp trung hòa huyết thanh với vi rút dịch tả vịt rồi tiêm trên phôi trứng vịt hoặc nhiễm trên tế bào xơ phôi vịt.

7.3.1  Phương pháp trung hòa huyết thanh trên phôi trứng vịt

Pha loãng huyết thanh cần phát hiện kháng thể thành các nồng độ từ 1/5, 1/10, 1/20 đến 1/1280. Trung hòa huyết thanh với liều 1000 ELD₅₀ (hoặc 100 EID₅₀) vi rút dịch tả vịt.

Tiêm hỗn hợp vào xoang niệu mô phôi trứng vịt (mỗi nồng độ tiêm 5 phôi), theo dõi trứng trong 10 ngày, sau đó mổ khám trứng chết và sống kiểm tra bệnh tích phôi.

Tính toán chỉ số trung hòa NI và hiệu giá trung hòa (xem Phụ lục B).

7.3.2  Phương pháp trung hòa huyết thanh trên tế bào xơ phôi vịt

Pha loãng huyết thanh cần phát hiện kháng thể thành các nồng độ từ 1/5, 1/10, 1/20 đến 1/1280. Trung hòa huyết thanh với liều 100 TCID₅₀ vi rút dịch tả vịt.

Gây nhiễm hỗn hợp trên lên tế bào xơ phôi vịt, theo dõi, kiểm tra bệnh tích tế bào trên môi trường nuôi cấy. Tính toán chỉ số trung hòa NI và hiệu giá trung hòa (xem Phụ lục C).

8  Kết luận

Vịt, ngan, ngỗng được xác định mắc bệnh dịch tả vịt khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh dịch tả vịt và phải có kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:

- Phân lập được vi rút trên phôi trứng vịt hoặc tế bào DEF và kết quả giám định dương tính vi rút dịch tả vịt.

- Phương pháp PCR cho kết quả dương tính.

- Phương pháp realtime PCR cho kết quả dương tính.

- Đối với con vật chưa tiêm phòng vắc xin dịch tả vịt có kết quả dương tính khi thực hiện phương pháp trung hòa huyết thanh trên phôi trứng vịt hoặc trên tế bào DEF.

 

Phụ Lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch muối đệm phốt phát pH ~ 7,2 (PBS).

Thành phần

Natri clorua (NaCl)	8,0 g
Kali clorua (KCl)	0,2 g
Natri hydrophosphat (Na2HPO4)	1,15 g
Kali dihydrophosphat (KH2PO4)	0,2 g
Nước cất	1000 ml

Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch NaHCO₃ 7 %

Thành phần: NaHCO₃ 7,0 g

Nước cất 100 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút và bảo quản ở 4°C.

A.3  Dung dịch L-glutamine 3%

Thành phần: L-glutamine 3 g

Nước cất 100 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Sau đó, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C.

A.4  Trypsin 0,5% (10 X)

Thành phần: Trypsin 0,5g

PBS 100 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên, khuấy đều bằng cá từ và để qua đêm ở 4 °C. Sau đó, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C.

A.5  Môi trường nuôi cấy tế bào

Thành phần: MEM (Eagle’s minimum essential medium) 435 ml

L-glutamine 3% 5 ml

NaHCO₃ 7% 5 ml

Kháng sinh (Penicillin + Streptomycin) 5 ml

FBS 50 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Dung dịch được bảo quản ở 4 °C.

A.6  Môi trường duy trì tế bào

Thành phần: MEM (Eagle’s minimum essential medium) 475 ml

L-glutamin 3 % 5 ml

NaHCO₃ 7 % 5 ml

Kháng sinh (Penicillin + Streptomycin) 5 ml

FBS 10 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Dung dịch được bảo quản ở 4 °C.

A.7  Dung dịch Tris-borate-EDTA (TBE) 10X

Thành phần: 89mM Tris base (FW = 121) 108 g

89 mM Boric acid (FW = 61,8) 55 g

0,5 M EDTA (pH 8,0) 40 ml

Nước cất hai lần 1000 ml

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ phòng.

 

Phụ Lục B

(Quy định)

Phân lập và giám định vi rút dịch tả vịt trên phôi trứng vịt

B.1  Phân lập vi rút

a) Tiêm bệnh phẩm vào phôi trứng vịt:

- Dùng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi (không có kháng thể kháng dịch tả vịt), lấy từ trại vịt sạch bệnh.

- Soi trứng, chọn phôi khỏe. Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm từ 3 phôi đến 5 phôi.

- Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70%. Dùi vị trí tiêm ở phía trên buồng hơi.

- Dùng bơm tiêm hút dịch bệnh phẩm đã xử lý vô trùng (bằng kháng sinh hoặc lọc qua màng lọc có kích thước 0,45 µm) rồi tiêm 0,2 ml vào xoang niệu mô.

- Gắn kín lỗ tiêm bằng keo.

- Ấp tiếp ở nhiệt độ từ 37 °C đến 38 °C. Mỗi ngày soi trứng 2 lần, loại bỏ phôi chết trước 24 giờ. Theo dõi 10 ngày sau tiêm.

- Các trứng có phôi chết hoặc gần chết được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C. Phôi nhiễm vi rút dịch tả vịt cường độc thường chết từ 3 ngày đến 8 ngày sau khi tiêm.

- Sau 10 ngày, các trứng không chết được giữ ở 4 °C để giết phôi.

b) Thu hoạch nước trứng

- Mổ trứng trong điều kiện vô trùng. Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70 %.

- Dùng kéo cắt quanh buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô.

- Hút nước trứng vào ống eppendorf vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 4 °C để kiểm tra.

B.2  Giám định vi rút

Dùng phương pháp trung hòa vi rút trên phôi trứng vịt.

- Pha loãng dịch niệu mô thu hoạch ở trên thành các nồng độ 10^-1 đến 10^-9 với dung dịch PBS (xem Phụ lục A).

- Lô đối chứng dương: trộn huyết thanh chuẩn kháng dịch tả vịt với dịch niệu mô đã pha loãng thành các nồng độ trên theo tỷ lệ 1:1.

- Lô đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với dịch niệu mô đã pha loãng thành các nồng độ trên theo tỷ lệ 1:1.

- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

- Tiêm hỗn hợp vào xoang niệu mô phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi, liều 0,2 ml/phôi; mỗi nồng độ tiêm 5 trứng.

- Ấp trứng trong tủ ấm 37 °C theo dõi trong 10 ngày. Loại bỏ trứng chết trong vòng 24 giờ. Ghi chép số phôi chết.

- Nếu có vi rút dịch tả vịt lô đối chứng dương phôi sẽ sống, lô đối chứng âm phôi sẽ chết trong khoảng 3 ngày đến 8 ngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.

- Dựa vào tỷ lệ sống chết của phôi để tính toán liều ELD₅₀ (hoặc EID₅₀) và chỉ số trung hòa NI theo công thức Reed & Muench để đánh giá kết quả.

- Chỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa ELD₅₀ (hoặc EID₅₀) của lô đối chứng dương tính và lô đối chứng âm tính.

- Kết quả dương tính khi NI ≥ 2.

Ví dụ: Thí nghiệm có kết quả chuẩn độ liều ELD₅₀ của vi rút dịch tả vịt như sau:

Nồng độ vi rút pha loãng	Số trứng chết/Số trứng tiêm	Phản ứng		Giá trị cộng dồn			Tỉ lệ chết %
		Chết	Sống	Chết	Sống	Tỷ số
10-6	5/5	5	0	11	0	11/11	100
10-7	4/5	4	1	6	1	6/7	86
10-8	2/5	2	3	2	4	2/6	33
10-9	0/5	0	5	0	9	0/9	0

Công thức Reed & Muench:

ELD₅₀ = ((A-50)/(A-B)) x (b-a) + a

ELD₅₀ = [((86-50)/(86-33)) x [(-8) - (7)] + (-7) = -7,7

Như vậy, liều gây chết 50% phôi trứng là 10 ^-7,7.

Tính chỉ số trung hòa:

Vi rút pha loãng (log10)	-1	-2	-3	-4	-5	-6	-7	-8	- log10 EID50	NI
Huyết thanh (-)					*5/5	4/5	1/5	0/5	6,5
Huyết thanh (+)	5/5	5/5	0/5						2,5	4,0

Kết quả: NI = 6,5 - 2,5 = 4,0

Kết luận: bệnh phẩm dương tính vi rút dịch tả vịt.

 

Phụ Lục C

(Quy định)

Phân lập và giám định vi rút dịch tả vịt trên tế bào xơ phôi vịt

C.1  Chuẩn bị tế bào xơ phôi vịt (DEF - Duck Embryo Fibroblast)

- Chọn trứng vịt có phôi từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi, phát triển tốt. Mổ trứng, lấy phôi.

- Rửa phôi trong dung dịch PBS có chứa 1 % kháng sinh.

- Cắt bỏ đầu, chân, cánh và các cơ quan phủ tạng.

- Rửa lại phôi từ 1 lần đến 2 lần trong dung dịch PBS có chứa 1 % kháng sinh.

- Cắt nhỏ phôi.

- Tách tế bào bằng dung dịch trypsin ấm 0,5 % và ly tâm nhẹ 250 g trong 15 phút.

- Thu hoạch tế bào đã tách bằng cách lọc qua 4 lần vải gạc, cho vào môi trường MEM (4.3.5).

- Ly tâm (5.2.3) huyễn dịch tế bào ở tốc độ 1500 g trong 5 phút ở 4 °C, loại bỏ phần nước trong.

- Rửa lại 1 lần với môi trường nuôi cấy.

- Đếm và pha loãng tế bào với môi trường phát triển (MEM + 10% FBS), lượng tế bào cần thiết tối thiểu 4 x 10⁵ tế bào/ml.

C.2  Phân lập vi rút dịch tả vịt trên tế bào DEF

- Cấy tế bào DEF trên các lọ nuôi tế bào T25 hoặc đĩa nuôi tế bào (đĩa 6 giếng, 24 giếng), sau 2 đến 3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý, thể tích nhiễm 100 µl/giếng hoặc 500 µl/lọ. Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá trình phân lập.

- Quan sát CPE trong các lọ nuôi cấy thời gian 7 ngày: Vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày. Nếu CPE đạt 70 % đến 80 % hoặc sau 7 ngày không có CPE thì tiến hành thu hoạch dịch tế bào.

- Cho các lọ nuôi cấy vào nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C làm đông, sau đó rã đông, lặp lại 3 lần, cuối cùng ly tâm và thu phần nước trong để giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần 2.

C.3  Giám định vi rút dịch tả vịt trên tế bào DEF

a) Chuẩn bị

- Tế bào DEF đã nuôi cấy được 2 ngày đến 3 ngày trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng.

- Pha loãng vi rút phân lập: các nồng độ từ 10^-1 đến 10^-9 với môi trường MEM (4.3.5) không bổ sung FBS.

- Lô đối chứng dương tính: trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1.

- Lô đối chứng âm tính: trộn huyết thanh âm tính dịch tả vịt với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1.

b) Tiến hành

- Gây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đã nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 giếng), 100µ/giếng, 8 giếng/nồng độ. Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 1 giờ.

- Sau 1 giờ ủ, cho môi trường nuôi cấy MEM (4.3.5) 100 µl/giếng.

- Tiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm ở 37 °C, 5 % CO₂ (5.3.3) từ 7 ngày đến 9 ngày.

- Hàng ngày kiểm tra bệnh tích tế bào (CPE) bằng kính hiển vi soi ngược (5.3.7), thường vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày.

c) Đánh giá kết quả

- Dựa vào kết quả CPE của 2 lô để tính liều TCID₅₀ và chỉ số trung hòa NI theo công thức Reed & Muench để đánh giá kết quả.

- Chỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa TCID₅₀ của lô đối chứng dương tính và lô đối chứng âm tính. Kết quả dương tính khi NI ≥ 2.

 

Phụ lục D

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF (5.2.2)

- Hút 200 µl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 µl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.3) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.4), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.4) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi DNA/RNA của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 µl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 µl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 µl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

 

Phụ lục E

(Tham khảo)

Quy trình kỹ thuật realtime PCR phát hiện ADN vi rút dịch tả vịt

Bảng E.1 - Trình tự mồi, đoạn dò phát hiện vi rút dịch tả vịt

STT	Tên mồi và đoạn dò	Trình tự (5’-3’)
1	Mồi xuôi DVE	CTCTACGCAGCTTTTGACGATTT
2	Mồi ngược DVE	AGAAACATACTGTGAGAGTGACGA
3	Đoạn dò DVE	FAM -CCTCCTCCTCGCTGAGTGGCATCC-BHQ_1

Bảng E.2 - Thành phần phản ứng realtime PCR

STT	Thành phần nguyên liệu	Nồng độ µM	Thể tích cho 1 phản ứng µl
1	Nước không có DNAse/RNAse		3,75
2	Mồi xuôi DVE	20	1,25
3	Mồi ngược DVE	20	1,25
4	Đoạn dò DVE	5	1,25
5	Dung dịch SuperMix		12,5
Tổng thể tích dung dịch cho 1 phản ứng			20
6	Mẫu đã chiết tách (ADN)		5
Tổng thể tích cho 1 phản ứng			25

Bảng E.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ °C	Thời gian	Số chu kỳ
50 (*)	02 phút (*)	01
95 (*)	02 phút (*)	01
95	15 giây	45
60	45 giây (Ghi nhận tín hiệu quang)
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kit PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG, Cat. No.: 11730-017

 

Phụ lục F

(Tham khảo)

Quy trình kỹ thuật PCR phát hiện ADN vi rút dịch tả vịt

F.1  Trình tự mồi phát hiện ADN vi rút

Áp dụng cho kít Hot Start Taq Gold DNA polymerase (nếu dùng kít khác có thể phải thay đổi công thức thực hiện).

Bảng F.1 - Trình tự mồi xuôi và mồi ngược

STT	Tên mồi	Trình tự (5’-3’)
1	Mồi xuôi DVE	GAA-GGC-GGG-TAT-GTA-ATG-TA
2	Mồi ngược DVE	CAA-GGC-TCT-ATT-CGG-TAA-TG

Bảng F.2 - Thành phần phản ứng PCR

Thành phần nguyên liệu	Nồng độ µM	Thể tích cho 1 phản ứng µl
Nước không có DNAse/RNAse		16,875
PCR Buffer II 10 X		2,5
MgCl2 25 nM		2
dNTP 10 nM		0,5
Mồi xuôi	10	0,5
Mồi ngược	10	0,5
Taq Gold DNA polymerase 5U		0,125
Mẫu chiết tách ADN		2,0
Tổng thể tích dung dịch cho 1 phản ứng		25,0

Bảng F.3 - Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Bước	Chu kỳ	Thời gian	Nhiệt độ °C
1	1	10 phút	95
2	35	15 giây	95
		1 phút	56
		2 phút	72
3	1	7 phút	72
Giữ ở 4 °C

C.2  Chạy điện di

- Chuẩn bị thạch Agarose (4.2.6) 1.5 % pha trong dung dịch TBE (4.2.6) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (4.2.7) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch dung dịch nạp mẫu (loading dye) (4.2.7)).

- Sử dụng thang chuẩn AND (100 bp) (4.2.9).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

- Đọc kết quả:

+ Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương 446 bp.

+ Mẫu âm tính: Không có vạch.

- Đánh giá kết quả: Có vi rút dịch tả vịt trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả PCR dương tính. Nếu kết quả nghi ngờ cần lấy sản phẩm PCR giải trình tự gen.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE (Office International des Epizooties), 2012. Duck virus enteritis. Chapter 2.3.7. Terrestrial Manual.

[2] Yang F.L., Jia W.X., Yue H., Luo W., Chen X., Xie Y., Zen W. and Yang W.Q., 2005, Development of quantitative real-time polymerase chain reaction for duck enteritis virus DNA. In Avian disease. American association of avian pathologists publishing, pp 397-400.

[3] Chi cục Thú y vùng VI, 2017. Phát hiện vi rút Dịch tả vịt bằng kỹ thuật realtime PCR.

[4] Hansen W.R., Nashold S.W., Docherty D., E., Brown S.E. and Knudson D.L. (2000). Diagnosis of Duck Plague in Waterfowl by Polymerase Chain Reaction. Avian Dis., 44: 266-274

---