Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7924-1:2019 (ISO 16649-1:2018) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính ß-glucuronidase - Phần 1: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44 ºC sử dụng màng lọc và 5-bromo-4-clo-3-indolyl ß -D-glucuronid do Bộ Khoa học và Công nghệ công bố, ban hành năm 2019. Tiêu chuẩn này đưa ra quy trình kỹ thuật chuẩn hóa nhằm định lượng chính xác vi khuẩn Escherichia coli trong chuỗi thực phẩm bằng phương pháp màng lọc, đặc biệt tối ưu cho các tế bào vi khuẩn bị tổn thương.

Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trên phạm vi rộng, áp dụng đối với các đối tượng sau:

• Các sản phẩm dành cho mục đích tiêu thụ của con người (thực phẩm).
• Các sản phẩm thức ăn dùng cho chăn nuôi động vật.
• Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, chế biến, phân phối và xử lý thực phẩm.
• Các mẫu thu thập từ giai đoạn sản xuất ban đầu như trồng trọt và chăn nuôi.

Phương pháp này được thiết kế đặc biệt để áp dụng cho các mẫu thử dự kiến có chứa các tế bào vi khuẩn bị tổn thương do quá trình xử lý công nghiệp hoặc bảo quản như xử lý nhiệt, sấy khô, đông lạnh, hoặc do tác động của các chất hóa học, chất bảo quản và môi trường axit.

Tài liệu viện dẫn bắt buộc

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác và đồng bộ, người sử dụng cần tham chiếu và tuân thủ các tài liệu kỹ thuật cốt lõi sau:

• TCVN 6404 (ISO 7218) về Nguyên tắc chung đối với kiểm tra vi sinh vật.
• TCVN 11130 (ISO 11133) về Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

Thuật ngữ và định nghĩa chuyên ngành

Tiêu chuẩn đưa ra định nghĩa pháp lý và kỹ thuật rõ ràng đối với đối tượng kiểm nghiệm:

• Escherichia coli dương tính beta-glucuronidase: Là nhóm vi khuẩn có khả năng hình thành các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh lục đặc trưng trên môi trường thạch chứa chất chỉ thị 5-bromo-4-clo-3-indolyl beta-D-glucuronid (TBX) dưới các điều kiện nuôi cấy và nhiệt độ quy định trong tiêu chuẩn này.

Nguyên lý cốt lõi của phương pháp đếm khuẩn lạc sử dụng màng lọc

Quy trình định lượng được thực hiện qua các bước kỹ thuật nghiêm ngặt nhằm đảm bảo khả năng phục hồi tối đa của vi khuẩn trước khi tiến hành chọn lọc:

• Giai đoạn phục hồi (Resuscitation): Chuyển một lượng mẫu thử hoặc dịch pha loãng ban đầu lên màng lọc cellulose axetat (hoặc màng lọc tương đương có kích thước lỗ 0,45 micromet). Đặt màng lọc này lên môi trường thạch glutamate biến tính (MMGA) và tiến hành ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong khoảng thời gian từ 4 giờ đến 5 giờ. Bước này giúp các tế bào vi khuẩn bị tổn thương phục hồi lại trạng thái sinh lý bình thường.
• Giai đoạn chọn lọc và ủ ấm (Selective incubation): Sau khi kết thúc giai đoạn phục hồi, chuyển màng lọc từ môi trường MMGA sang môi trường thạch chọn lọc TBX (chứa muối mật để ức chế vi khuẩn Gram dương và chất chỉ thị màu BCIG). Tiến hành ủ ấm ở nhiệt độ 44 độ C trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ.
• Đọc kết quả và tính toán mật độ: Đếm các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh lục xuất hiện trên màng lọc. Sự xuất hiện màu sắc này là do hoạt tính của enzym beta-glucuronidase có trong vi khuẩn E. coli phân hủy chất chỉ thị màu BCIG tạo thành hợp chất màu xanh không tan tích tụ trong khuẩn lạc. Tiến hành tính toán số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của E. coli dương tính beta-glucuronidase trên mỗi gam hoặc mỗi mililit mẫu thử.

Hiệu lực thi hành và lưu ý áp dụng

TCVN 7924-1:2019 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 16649-1:2018 và thay thế cho tiêu chuẩn cũ TCVN 7924-1:2008. Việc áp dụng kỹ thuật màng lọc kết hợp phục hồi sinh lý giúp tăng độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao hơn so với các phương pháp truyền thống, đặc biệt hiệu quả khi phân tích các mẫu thực phẩm chế biến sâu hoặc mẫu có mật độ vi sinh vật thấp.