Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4884-2:2015 (hoàn toàn tương đương với ISO 4833-2:2013 và đính chính kỹ thuật 1:2014) quy định phương pháp chung để định lượng vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Dưới đây là phần tóm tắt chi tiết nội dung từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này, tập trung vào phạm vi áp dụng, tài liệu viện dẫn, thuật ngữ định nghĩa và nguyên tắc thực hiện.

- Điều 1: Phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi sinh vật có khả năng phát triển và hình thành khuẩn lạc trên bề mặt môi trường đặc sau khi ủ hiếu khí ở 30 độ C. Phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn rất rộng rãi, bao gồm:

• Các sản phẩm dành cho sự tiêu thụ của con người và thức ăn dành cho động vật.
• Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, chế biến và xử lý thực phẩm.
• Các mẫu thu được từ giai đoạn sản xuất ban đầu (như mẫu môi trường nông nghiệp, chăn nuôi).

Phương pháp cấy bề mặt này đặc biệt phù hợp và được khuyến cáo áp dụng cho các trường hợp cụ thể sau:

• Các sản phẩm chứa các vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt độ cao (có thể bị chết hoặc ức chế khi đổ đĩa bằng thạch nóng chảy ở 44 độ C đến 47 độ C).
• Các sản phẩm chứa các vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần tiếp xúc trực tiếp với không khí để phát triển tối ưu trên bề mặt thạch.
• Các sản phẩm có chứa các hạt nhỏ hoặc tạp chất có thể gây nhầm lẫn với khuẩn lạc khi sử dụng phương pháp đổ đĩa sâu.
• Các trường hợp yêu cầu độ chính xác cao đối với việc phân biệt các dạng khuẩn lạc khác nhau trên bề mặt môi trường.
• Các loại thực phẩm có màu sắc đậm hoặc đục, gây khó khăn cho việc quan sát khuẩn lạc chìm trong lòng thạch.

- Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, việc viện dẫn các tài liệu tiêu chuẩn liên quan là bắt buộc. Các tài liệu viện dẫn cốt lõi bao gồm:

• TCVN 6404 (ISO 7218) về Nguyên tắc chung đối với kiểm tra vi sinh vật. Đây là tiêu chuẩn nền tảng quy định các yêu cầu kỹ thuật về trang thiết bị, an toàn phòng thí nghiệm và cách thức vận hành chung.
• Chuỗi tiêu chuẩn TCVN 6507 (ISO 6887) về Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.
• ISO 11133 về Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

- Điều 3: Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn đưa ra định nghĩa rõ ràng về đối tượng đích cần định lượng nhằm thống nhất cách hiểu và thực hiện:

• Vi sinh vật (Microorganisms): Là các vi khuẩn, nấm men và nấm mốc có khả năng hình thành các khuẩn lạc có thể đếm được khi được nuôi cấy trên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng (như thạch đếm đĩa - Plate Count Agar) dưới các điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 30 độ C trong khoảng thời gian quy định (thường là 72 giờ).

- Điều 4: Nguyên tắc của phương pháp cấy bề mặt

Phương pháp định lượng vi sinh vật bằng kỹ thuật cấy bề mặt được tiến hành dựa trên các bước nguyên tắc nghiêm ngặt sau:

• Chuẩn bị đĩa thạch: Sử dụng các đĩa thạch dinh dưỡng đã được chuẩn bị sẵn và làm khô bề mặt trước khi cấy để đảm bảo dịch mẫu thử hấp thụ nhanh chóng, không bị loang loãng hoặc chảy tràn.
• Cấy mẫu: Phân phối một thể tích xác định (thường là 0,1 ml) của mẫu thử dạng lỏng, hoặc của huyền phù ban đầu (đối với mẫu dạng rắn), hoặc của các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo lên bề mặt của đĩa môi trường thạch.
• Trải mẫu: Sử dụng que cấy gạt vô trùng (que cấy trải dạng chữ L hoặc tam giác) để dàn đều lượng dịch mẫu thử lên khắp bề mặt đĩa thạch một cách nhanh chóng và nhẹ nhàng, tránh làm rách bề mặt thạch.
• Ủ ấm: Lật ngược các đĩa thạch đã cấy và tiến hành ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 độ C trong khoảng thời gian 72 giờ (sai số cho phép thường là cộng trừ 3 giờ) dưới điều kiện hiếu khí.
• Tính kết quả: Sau thời gian ủ, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa thạch có mật độ phù hợp (thường chọn các đĩa có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 10 đến 300 khuẩn lạc để đảm bảo độ tin cậy thống kê). Từ số lượng khuẩn lạc đếm được và hệ số pha loãng tương ứng, tính toán số lượng vi sinh vật có trong một gam (g) hoặc một mililít (ml) mẫu thử ban đầu.