Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2012 quy định phương pháp xác định hàm lượng các 5'-mononucleotid trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Dưới đây là tóm tắt chi tiết nội dung Phần mở đầu và các điều khoản đầu từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này:

- Điều 1: Phạm vi áp dụng

• Tiêu chuẩn này quy định quy trình phân tích để xác định hàm lượng của 5'-mononucleotid bao gồm: cytidin 5'-monophosphat (CMP), adenosin 5'-monophosphat (AMP), uridin 5'-monophosphat (UMP), guanosin 5'-monophosphat (GMP) và inosin 5'-monophosphat (IMP) có trong các sản phẩm thực phẩm.
• Phương pháp này đặc biệt phù hợp và được áp dụng phổ biến đối với các sản phẩm sữa công thức dành cho trẻ em và các sản phẩm dinh dưỡng y tế, giúp kiểm soát chính xác hàm lượng dinh dưỡng bổ sung theo quy chuẩn.

- Điều 2: Tài liệu viện dẫn

• Các tài liệu viện dẫn là bộ phận cấu thành không thể tách rời khi áp dụng tiêu chuẩn này. Trong trường hợp các tài liệu viện dẫn có sự thay đổi, bổ sung hoặc được thay thế bằng phiên bản mới, người sử dụng cần áp dụng phiên bản mới nhất.
• Tiêu chuẩn viện dẫn cốt lõi bao gồm TCVN 4851 (ISO 3696) về nước dùng trong phòng thí nghiệm phân tích, nhằm đảm bảo chất lượng nước sử dụng đạt tiêu chuẩn tinh khiết cao nhất, không gây nhiễu kết quả phân tích sắc ký.

- Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp

• Quá trình phân tích bắt đầu bằng việc chiết xuất các hợp chất 5'-mononucleotid từ mẫu thực phẩm bằng dung dịch đệm thích hợp hoặc nước ấm dưới điều kiện kiểm soát pH nghiêm ngặt để giải phóng hoàn toàn các chất cần phân tích ra khỏi cấu trúc nền mẫu.
• Dịch chiết sau đó được tiến hành lọc qua màng lọc chuyên dụng (thường là màng lọc có kích thước lỗ 0,45 µm hoặc nhỏ hơn) để loại bỏ hoàn toàn các tạp chất lơ lửng và các phân tử lớn có khả năng gây tắc nghẽn hệ thống sắc ký.
• Hỗn hợp sau khi làm sạch được bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Quá trình phân tách các mononucleotid được thực hiện trên cột pha đảo (thường là cột C18) kết hợp với việc sử dụng chương trình dung môi pha động (rửa giải đẳng dòng hoặc rửa giải theo chương trình dung môi) phù hợp.
• Việc phát hiện và định lượng các chất được thực hiện bằng detector tử ngoại (UV) ở bước sóng hấp thụ đặc trưng (thường là 254 nm hoặc 260 nm). Hàm lượng của từng mononucleotid được tính toán dựa trên việc so sánh thời gian lưu và diện tích pic của mẫu thử với các pic của dung dịch chuẩn tương ứng.

- Điều 4: Thuốc thử và vật liệu thử

• Yêu cầu chung: Tất cả các hóa chất, dung môi và thuốc thử được sử dụng trong quá trình phân tích phải đạt độ tinh khiết phân tích cao hoặc loại chuyên dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nước sử dụng phải tuân thủ nghiêm ngặt yêu cầu của nước loại 1 theo tiêu chuẩn TCVN 4851.
• Các chất chuẩn tinh khiết bao gồm: Adenosin 5'-monophosphat (AMP), Cytidin 5'-monophosphat (CMP), Guanosin 5'-monophosphat (GMP), Inosin 5'-monophosphat (IMP), và Uridin 5'-monophosphat (UMP) với hàm lượng hoạt chất đã được xác định rõ ràng để pha chế các dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn làm việc.
• Hóa chất pha động và dung dịch đệm: Bao gồm các muối photphat (như kali dihydro photphat), các dung môi hữu cơ tinh khiết (như methanol, acetonitril) và các chất điều chỉnh pH (như axit photphoric hoặc natri hydroxit) nhằm thiết lập môi trường pH tối ưu cho quá trình phân tách các chất trên cột sắc ký.