TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9515:2012

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH 5'-MONONUCLEOTID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodstuffs - Determination of 5'-mononucleotides by high performance liquid chromatography (HPLC)

Lời nói đầu

TCVN 9515:2012 được xây dựng dựa trên cơ sở AOAC 2011.20 Routine analysis of 5'-mononucleotides in infant formula and adult/pediatric nutritional formula by liquid chromatography;

TCVN 9515:2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH 5'-MONONUCLEOTID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodstuffs - Determination of 5'-mononucleotides by high performance liquid chromatography (HPLC)

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng 5'-mononucleotid trong thực phẩm bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trên các mẫu thức ăn công thức dùng cho trẻ sơ sinh và sản phẩm bổ sung 5'-mononucleotid dành cho người lớn.

2. Nguyên tắc

Mẫu thử được hòa tan trong dung dịch có nồng độ muối cao để ức chế các tương tác với protein và chất béo. Các hợp chất 5'-mononucleotid gồm uridin 5'-monophosphat (UMP), inosin 5'-monophosphat (IMP), adenosin 5'-monophosphat (AMP), guanosin 5'-monophosphat (GMP) và cytidin 5'-phosphat (CMP) được phân tách từ nền mẫu bằng chiết pha rắn trao đổi anion mạnh (SPE) sau đó phân tích bằng sắc kí dùng cột pha tĩnh C₁₈, gradient rửa giải, dùng detector UV và định lượng bằng kĩ thuật nội chuẩn dùng thymidin 5'-monophosphat (TMP).

3. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước có điện trở suất không nhỏ hơn 18 MW cm, trừ khi có quy định khác.

3.1. Metanol

3.2. Dung dịch đệm, kali dihydro phosphat (KH₂PO₄), 0,25M, pH 3,5

Hòa tan 34,02g kali dihydro phosphat trong 900 ml nước và chỉnh pH đến 3,5 bằng axit orthophosphoric. Pha loãng đến 1 lít.

3.3. Dung dịch chiết, natri clorua (NaCl) 1 M và axit etylendiamintetraaxetic (EDTA) 5mM

Hòa tan 58,5 g natri clorua và 1,46 g EDTA trong nước. Pha loãng đến 1 lít.

3.4. Dung dịch kali bromua (KBr), 0,3 M

Hòa tan 3,57g kali bromua trong 100ml nước.

3.5. Dung dịch rửa giải, kali dihydro phosphat (KH₂PO₄), 0,5 M, pH 3,0

Hòa tan 6,805 g kali dihydro phosphat trong 90 ml nước và chỉnh pH đến 3,0 bằng axit orthophosphoric. Pha loãng đến 100 ml.

3.6. Dung môi pha động A, kali dihydro phosphat (KH₂PO₄), 10mM, pH 5,6

Hòa tan 1,36 g kali dihydro phosphat trong 900ml nước và chỉnh pH đến 5,6 bằng dung dịch kali hydroxit (KOH) 10% (khối lượng/thể tích). Pha loãng bằng nước đến 1 lít.

Chuẩn bị dung dịch trong ngày sử dụng.

CHÚ THÍCH: Việc chuẩn bị dung dịch trong ngày sử dụng để tránh sự phát triển của vi sinh vật trong đệm phosphat ở nhiệt độ phòng khi dung dịch đệm chứa hàm lượng thấp hoặc không chứa dung môi vô cơ.

3.7. Dung môi pha động B, 100% metanol.

3.8. Chất chuẩn và dung dịch chuẩn

3.8.1. Chất chuẩn

Sử dụng các chất chuẩn có độ tinh khiết ≥ 99% (sản phẩm của Sigma hoặc tương đương):

TMP.-CAS No. 365-07-1

AMP.-CAS No. 61-19-8

CMP.-CAS No. 63-37-6

GMP.-CAS No. 85-32-5