Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2017 (ISO 20638:2015) quy định phương pháp xác định hàm lượng các nucleotid trong thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và sản phẩm dinh dưỡng dành cho người lớn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Dưới đây là tóm tắt chi tiết các nội dung cốt lõi từ Phần mở đầu và các điều khoản đầu tiên (Điều 1 đến Điều 4) của tiêu chuẩn này.

- Điều 1: Phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng (LC) để xác định hàm lượng của năm loại nucleotid đơn phosphate (5'-monophosphate) bao gồm: Cytidin 5'-monophosphate (CMP), Uridin 5'-monophosphate (UMP), Adenosin 5'-monophosphate (AMP), Guanosin 5'-monophosphate (GMP) và Inosin 5'-monophosphate (IMP).
• Đối tượng áp dụng: Phương pháp này được thiết kế đặc biệt cho các sản phẩm thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và các sản phẩm dinh dưỡng dành cho người lớn ở các dạng dạng bột, dạng lỏng cô đặc hoặc dạng lỏng sẵn dùng.
• Mục đích: Đảm bảo kiểm soát chính xác hàm lượng nucleotid bổ sung hoặc tự nhiên có trong sản phẩm dinh dưỡng, phục vụ công tác kiểm tra chất lượng và an toàn thực phẩm.

- Điều 2: Tài liệu viện dẫn liên quan

• Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, việc viện dẫn các tài liệu kỹ thuật là bắt buộc. Tài liệu viện dẫn cốt lõi bao gồm TCVN 4851 (ISO 3696) về nước dùng cho phòng thử nghiệm phân tích.
• Yêu cầu về nước: Nước sử dụng trong toàn bộ quá trình phân tích phải đạt chất lượng tối thiểu là loại 1 hoặc loại 2 theo quy định của tiêu chuẩn viện dẫn để tránh gây nhiễu kết quả sắc ký.

- Điều 3: Nguyên tắc xác định nucleotid

• Quá trình chuẩn bị mẫu: Các nucleotid trong mẫu thử được hòa tan hoặc chiết xuất bằng dung dịch đệm thích hợp. Đối với các mẫu có chứa protein hoặc chất béo phức tạp, quá trình kết tủa protein và lọc sạch được thực hiện để thu được dịch chiết trong suốt.
• Quá trình phân tách sắc ký: Dịch chiết sau khi làm sạch được bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Việc phân tách năm loại nucleotid (CMP, UMP, AMP, GMP, IMP) được thực hiện trên cột sắc ký pha đảo (thường là cột C18 hoặc cột trao đổi ion tương đương) sử dụng chương trình dung môi rửa giải (pha động) phù hợp.
• Quá trình phát hiện và định lượng: Các nucleotid được phát hiện bằng đầu dò tử ngoại (UV) ở bước sóng hấp thụ cực đại (thường là 260 nm). Hàm lượng của từng nucleotid được xác định bằng cách so sánh diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử với đường chuẩn của các chất chuẩn tương ứng.

- Điều 4: Yêu cầu về hóa chất, thuốc thử và vật liệu

• Yêu cầu chung: Tất cả các hóa chất được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích chuyên dùng cho sắc ký lỏng (grade HPLC) để đảm bảo độ nhạy và độ lặp lại của phép đo.
• Chất chuẩn đối chứng: Phải sử dụng các chất chuẩn có độ tinh khiết cao (tối thiểu 95% hoặc theo chứng nhận của nhà sản xuất) của năm loại nucleotid bao gồm muối natri hoặc dạng acid tự do của AMP, CMP, GMP, IMP và UMP.
• Pha động và dung dịch đệm: Các dung dịch đệm photphat, dung dịch điều chỉnh pH (như acid phosphoric hoặc natri hydroxyd) và các dung môi hữu cơ (như methanol, acetonitril) phải được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,22 µm hoặc 0,45 µm và khử khí hoàn toàn trước khi sử dụng.
• Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Hướng dẫn chi tiết cách pha chế dung dịch chuẩn gốc của từng nucleotid và dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc ở các dải nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn tuyến tính.