Tóm tắt Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11134:2015 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 22174:2005. Đây là tiêu chuẩn khung đưa ra các yêu cầu chung, định nghĩa và hướng dẫn kỹ thuật cơ bản đối với việc ứng dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Dưới đây là phần tóm tắt chi tiết nội dung từ Phần mở đầu đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

- Phạm vi áp dụng (Điều 1)

• Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu chung về việc khuếch đại axit nucleic (phương pháp PCR) nhằm phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
• Phạm vi áp dụng bao gồm toàn bộ quy trình từ giai đoạn chuẩn bị mẫu, chiết tách axit nucleic (DNA hoặc RNA), thực hiện phản ứng khuếch đại cho đến giai đoạn phát hiện và xác định sản phẩm PCR.
• Các hướng dẫn trong tiêu chuẩn này cũng được khuyến khích áp dụng cho việc kiểm nghiệm các mẫu môi trường xung quanh khu vực sản xuất, chế biến thực phẩm hoặc các mẫu thử nghiệm liên quan khác.

- Tài liệu viện dẫn (Điều 2)

• Tiêu chuẩn này viện dẫn các tài liệu kỹ thuật cốt lõi để đảm bảo tính đồng bộ trong quá trình thực hiện phân tích vi sinh.
• Tài liệu viện dẫn quan trọng nhất là TCVN 6404 (ISO 7218) về nguyên tắc chung đối với các thử nghiệm vi sinh vật lâm sàng và thực phẩm. Việc áp dụng TCVN 11134:2015 phải luôn đi kèm và tuân thủ các nguyên tắc an toàn sinh học và vận hành phòng thí nghiệm được quy định trong tài liệu viện dẫn này.

- Thuật ngữ và định nghĩa (Điều 3)

Để đảm bảo tính thống nhất trong cách hiểu và áp dụng giữa các phòng thử nghiệm trên toàn quốc và quốc tế, tiêu chuẩn định nghĩa rõ ràng các thuật ngữ chuyên ngành:

• Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR): Kỹ thuật sinh học phân tử in vitro dùng để khuếch đại một cách chọn lọc các trình tự DNA đích cụ thể thông qua các chu kỳ nhiệt lặp đi lặp lại.
• Mồi (Primer): Đoạn oligonucleotide ngắn, có trình tự bổ sung với sợi khuôn DNA mục tiêu, đóng vai trò khởi đầu cho quá trình tổng hợp DNA mới của enzyme polymerase.
• Kiểm soát dương tính (Positive Control): Mẫu chứng chứa trình tự DNA đích đã biết trước, được đưa vào quá trình phân tích để chứng minh hệ thống phản ứng PCR hoạt động bình thường và hiệu quả.
• Kiểm soát âm tính (Negative Control): Mẫu chứng không chứa trình tự DNA đích (thường dùng nước cất hai lần vô trùng), dùng để kiểm soát và phát hiện hiện tượng ngoại nhiễm hoặc phản ứng chéo trong quá trình thao tác.
• Giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD): Số lượng hoặc nồng độ vi sinh vật tối thiểu có trong mẫu thử mà phương pháp PCR có thể phát hiện được với một mức độ tin cậy xác định.

- Yêu cầu chung và tổ chức phòng thử nghiệm (Điều 4)

Do tính nhạy cảm cao của phương pháp PCR, nguy cơ xảy ra hiện tượng dương tính giả do lây nhiễm chéo axit nucleic là rất lớn. Vì vậy, tiêu chuẩn đặt ra các yêu cầu nghiêm ngặt về tổ chức phòng thử nghiệm:

• Phân khu chức năng độc lập: Phòng thử nghiệm PCR bắt buộc phải được chia thành các khu vực riêng biệt về mặt vật lý. Các khu vực tối thiểu bao gồm: Khu vực chuẩn bị hóa chất/môi trường (sạch nhất); Khu vực chuẩn bị mẫu và chiết tách axit nucleic; Khu vực thiết lập phản ứng PCR; Khu vực khuếch đại và phân tích sản phẩm sau PCR (khu vực có nguy cơ nhiễm cao nhất).
• Nguyên tắc vận hành một chiều: Luồng di chuyển của nhân sự, mẫu thử, dụng cụ và chất thải phải tuân thủ nghiêm ngặt nguyên tắc một chiều (từ khu vực sạch đến khu vực bẩn). Tuyệt đối không mang dụng cụ, thiết bị hoặc trang phục bảo hộ từ khu vực sau PCR quay trở lại các khu vực trước PCR khi chưa được khử trùng.
• Trang thiết bị chuyên dụng: Mỗi phân khu chức năng phải được trang bị riêng biệt các thiết bị như pipet tự động, đầu tip có màng lọc, máy ly tâm, áo choàng phòng thí nghiệm và găng tay. Không dùng chung các dụng cụ này giữa các phòng để tránh lây nhiễm chéo.
• Kiểm soát chất lượng nội bộ: Phòng thử nghiệm phải thiết lập quy trình kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt, bao gồm việc sử dụng định kỳ các mẫu chứng âm, chứng dương và chứng nội (internal control) trong mỗi lần chạy phản ứng để kiểm soát sai sót kỹ thuật.