Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11047:2015 quy định phương pháp đo huỳnh quang để xác định hàm lượng histamine trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Đây là phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao, được áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm thủy sản. Dưới đây là tóm tắt chi tiết nội dung từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

1. Phạm vi áp dụng (Điều 1)

Điều khoản này xác định rõ đối tượng và phạm vi sử dụng của tiêu chuẩn:

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng histamine trong các loại thủy sản và sản phẩm thủy sản.
• Phương pháp đo huỳnh quang được áp dụng cho các mẫu thử là cá tươi, cá đông lạnh, các sản phẩm thủy sản đã qua chế biến (như nước mắm, cá hộp, cá khô) nhằm kiểm soát hàm lượng histamine - một tác nhân gây dị ứng nguy hiểm thường xuất hiện do sự phân hủy của axit amin histidine bởi vi khuẩn.

2. Tài liệu viện dẫn (Điều 2)

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, các tài liệu viện dẫn sau đây là cực kỳ cần thiết:

• TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. Việc sử dụng nước có chất lượng phù hợp (thường là nước loại 1 hoặc loại 2) là bắt buộc để tránh các tạp chất gây nhiễu tín hiệu huỳnh quang.
• Các tài liệu viện dẫn khác liên quan đến việc lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử đối với thủy sản và sản phẩm thủy sản nhằm đảm bảo tính đại diện của mẫu phân tích.

3. Nguyên tắc của phương pháp (Điều 3)

Nguyên tắc của phương pháp đo huỳnh quang xác định histamine được thực hiện qua các bước kỹ thuật chặt chẽ sau:

• Chiết xuất: Histamine có trong mẫu thủy sản được chiết xuất hoàn toàn bằng dung dịch methanol nóng hoặc lạnh tùy thuộc vào trạng thái mẫu.
• Làm sạch và tách tạp chất: Dịch chiết methanol sau đó được cho đi qua cột trao đổi ion chứa nhựa Dowex 1-X8 (hoặc loại tương đương) để loại bỏ các chất gây nhiễu khác có khả năng phản ứng với thuốc thử.
• Phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang: Histamine sau khi được làm sạch sẽ phản ứng với o-phthalaldehyde (OPA) trong môi trường kiềm (dung dịch natri hydroxit) để tạo thành một phức chất dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang mạnh.
• Ổn định phức chất: Phản ứng được làm bền bằng cách axit hóa hỗn hợp bằng dung dịch axit phosphoric.
• Đo cường độ huỳnh quang: Cường độ huỳnh quang của phức chất được đo bằng thiết bị đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích khoảng 350 nm và bước sóng phát xạ khoảng 444 nm. Hàm lượng histamine được tính toán dựa trên đường chuẩn được xây dựng từ dung dịch histamine chuẩn.

4. Thuốc thử và vật liệu thử (Điều 4)

Yêu cầu về hóa chất, thuốc thử sử dụng trong phương pháp phải đạt độ tinh khiết phân tích cao để đảm bảo độ chính xác của phép đo:

• Nước cất hoặc nước khử ion: Phù hợp với yêu cầu của TCVN 4851 (ISO 3696).
• Methanol: Loại tinh khiết dùng cho sắc ký hoặc phân tích phổ.
• Nhựa trao đổi ion: Nhựa Dowex 1-X8 (50 mesh đến 100 mesh hoặc 100 mesh đến 200 mesh) dạng liên kết chéo, được chuẩn bị và hoạt hóa trước khi nạp vào cột.
• Thuốc thử o-phthalaldehyde (OPA): Được hòa tan trong methanol tinh khiết. Thuốc thử này cần được bảo quản lạnh, tránh ánh sáng và chuẩn bị mới định kỳ để đảm bảo hoạt tính phản ứng.
• Dung dịch chuẩn histamine: Được chuẩn bị từ histamine dihydrochloride (C5H9N3.2HCl) tinh khiết. Dung dịch chuẩn gốc được pha trong dung dịch axit clohydric (HCl) và từ đó pha loãng thành các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ phù hợp để dựng đường chuẩn.
• Dung dịch natri hydroxit (NaOH): Nồng độ phù hợp (thường là 1 N) dùng để tạo môi trường kiềm cho phản ứng tạo dẫn xuất.
• Dung dịch axit phosphoric (H3PO4): Nồng độ phù hợp (thường là 3,57 N) dùng để dừng phản ứng và ổn định phức chất huỳnh quang.
• Dung dịch axit clohydric (HCl): Dùng để chuẩn bị dung dịch chuẩn và hoạt hóa cột trao đổi ion.