Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 4830-2:2005 (hoàn toàn tương đương với ISO 6888-2:1999 và sửa đổi AMD 1:2003) do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành là một văn bản kỹ thuật quan trọng trong lĩnh vực kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng staphylococci có phản ứng dương tính coagulase (bao gồm Staphylococcus aureus và các loài khác) bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ. Dưới đây là tóm tắt chi tiết nội dung từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

- Điều 1: Phạm vi áp dụng

Điều khoản này xác định rõ giới hạn và đối tượng áp dụng của phương pháp định lượng vi sinh vật, cụ thể như sau:

• Đối tượng áp dụng: Tiêu chuẩn này áp dụng rộng rãi cho các sản phẩm thực phẩm dành cho con người và các loại thức ăn dành cho chăn nuôi động vật.
• Phương pháp thực hiện: Quy định phương pháp chuẩn để định lượng staphylococci dương tính coagulase bằng cách đếm khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc (môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ) sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 35 độ C hoặc 37 độ C.
• Tính đặc thù của môi trường: Khác với Phần 1 (sử dụng môi trường Baird-Parker cần thử nghiệm khẳng định coagulase riêng biệt), Phần 2 sử dụng môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ cho phép nhận biết trực tiếp phản ứng coagulase của khuẩn lạc ngay trên đĩa thạch mà không cần tiến hành thêm bước thử nghiệm khẳng định, giúp tối ưu hóa thời gian và chi phí thử nghiệm.

- Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác và đồng bộ, người sử dụng cần phối hợp áp dụng các tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế liên quan sau đây:

• TCVN 6404 (ISO 7218): Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật. Đây là tài liệu nền tảng quy định các yêu cầu kỹ thuật chung về phòng thử nghiệm, thiết bị và thao tác cơ bản.
• TCVN 6507 (ISO 6887) các phần liên quan: Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phục ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.
• Các tài liệu viện dẫn nêu trên đều được áp dụng phiên bản mới nhất được công bố để đảm bảo tính cập nhật và đồng bộ về mặt kỹ thuật pháp lý.

- Điều 3: Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn đưa ra định nghĩa chính xác về đối tượng cần định lượng nhằm thống nhất cách hiểu trong quá trình phân tích:

• Staphylococci có phản ứng dương tính coagulase: Là những vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình hoặc không điển hình trên môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ (môi trường RPF) và thể hiện phản ứng coagulase dương tính rõ rệt ngay trên môi trường này.
• Đặc điểm khuẩn lạc điển hình trên môi trường RPF: Khuẩn lạc có màu đen hoặc xám, hoặc đôi khi là màu trắng, được bao quanh bởi một vòng kết tủa màu đục (thể hiện hoạt tính coagulase). Vòng kết tủa này xuất hiện rõ ràng do sự chuyển hóa fibrinogen thành fibrin nhờ enzyme coagulase do vi khuẩn tiết ra.

- Điều 4: Nguyên tắc của phương pháp

Nguyên tắc định lượng được xây dựng dựa trên quy trình kỹ thuật chuẩn hóa gồm các bước cơ bản sau:

• Bước 1: Cấy mẫu: Tiến hành cấy một lượng thể tích xác định của mẫu thử (nếu là chất lỏng) hoặc một lượng thể tích xác định của huyền phù ban đầu (đối với các sản phẩm khác) lên bề mặt môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ đựng trong đĩa Petri.
• Bước 2: Cấy các độ pha loãng: Thực hiện cấy song song các đĩa thạch khác trong cùng điều kiện bằng cách sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu để đảm bảo dải mật độ khuẩn lạc phù hợp cho việc đếm.
• Bước 3: Ủ ấm: Tiến hành ủ các đĩa đã cấy trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 35 độ C hoặc 37 độ C. Thời gian ủ tiêu chuẩn là từ 18 giờ đến 24 giờ, có thể kéo dài thêm nếu cần thiết để các khuẩn lạc phát triển rõ rệt.
• Bước 4: Tính toán kết quả: Đếm số lượng khuẩn lạc điển hình (có vòng kết tủa bao quanh) xuất hiện trên các đĩa thạch được chọn. Từ số lượng khuẩn lạc đếm được, tiến hành tính toán số lượng staphylococci có phản ứng dương tính coagulase trên một gam hoặc trên một mililít mẫu thử ban đầu theo công thức quy định.