Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7924-1:2008

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7924-1:2008 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 16649-1:2001, quy định phương pháp định lượng vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Cụ thể, tiêu chuẩn này hướng dẫn phương pháp định lượng vi khuẩn Escherichia coli dương tính beta-glucuronidaza bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở nhiệt độ 44 độ C, sử dụng màng lọc và chất nền chromogenic 5-bromo-4-clo-3-indolyl beta-D-glucuronid (BCIG).

Điều 1: Phạm vi áp dụng

Phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn được xác định cụ thể nhằm đảm bảo tính chính xác và hiệu quả của phương pháp đo lường:

• Tiêu chuẩn này áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng của con người và các sản phẩm thức ăn dành cho chăn nuôi gia súc, gia cầm.
• Phương pháp này đặc biệt phù hợp để định lượng các tế bào vi khuẩn có khả năng bị tổn thương do các quá trình xử lý công nghiệp trước đó (như sấy khô, làm lạnh đông, hoặc xử lý nhiệt nhẹ). Giai đoạn phục hồi tích hợp trong quy trình giúp tối ưu hóa khả năng sống sót và phát triển của vi khuẩn.
• Tiêu chuẩn có giới hạn áp dụng đối với các sản phẩm có độ đục cao, chứa nhiều hạt lơ lửng hoặc các chất keo có thể làm tắc nghẽn màng lọc hoặc gây cản trở trực tiếp đến việc quan sát, đếm khuẩn lạc sau khi nuôi cấy.

Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây là bắt buộc và không thể tách rời khi áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu, đối với tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất:

• TCVN 6404 (ISO 7218) về Nguyên tắc chung đối với việc kiểm tra vi sinh vật.
• TCVN 6507 (ISO 6887) các phần liên quan về chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.

Điều 3: Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn đưa ra định nghĩa thống nhất cho đối tượng kiểm nghiệm chính:

• Escherichia coli dương tính beta-glucuronidaza: Là nhóm vi khuẩn có khả năng hình thành các khuẩn lạc màu xanh lam đặc trưng trên môi trường thạch chọn lọc chứa chất nền 5-bromo-4-clo-3-indolyl beta-D-glucuronid (BCIG) ở nhiệt độ 44 độ C, dưới các điều kiện thử nghiệm nghiêm ngặt được quy định trong tiêu chuẩn này.

Điều 4: Nguyên lý của phương pháp

Quy trình định lượng dựa trên nguyên lý sinh hóa và sinh lý học của vi khuẩn thông qua các bước tuần tự:

• Giai đoạn lọc và phục hồi (Resuscitation): Một lượng mẫu thử hoặc dung dịch pha loãng mẫu xác định được lọc qua màng lọc cellulose axetat (hoặc màng lọc tương đương có kích thước lỗ 0,45 micromet). Màng lọc sau đó được đặt lên môi trường phục hồi không chọn lọc (thạch glutamate biến tính - MMGA) và tiến hành ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong thời gian từ 4 giờ đến 5 giờ. Bước này giúp các tế bào E. coli bị tổn thương phục hồi chức năng sinh lý trước khi chịu tác động của các chất ức chế chọn lọc.
• Giai đoạn nuôi cấy chọn lọc (Selective incubation): Sau khi kết thúc giai đoạn phục hồi, chuyển màng lọc sang môi trường chọn lọc thạch mật-glucuronid (TBX) có chứa chất nền BCIG. Tiến hành ủ ấm ở nhiệt độ 44 độ C trong khoảng thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ.
• Phản ứng sinh hóa tạo màu: Enzyme beta-glucuronidaza có trong tế bào vi khuẩn E. coli sẽ thủy phân liên kết trong chất nền 5-bromo-4-clo-3-indolyl beta-D-glucuronid, giải phóng ra hợp chất màu xanh lam không hòa tan. Hợp chất này tích tụ bên trong khuẩn lạc, giúp định dạng rõ ràng các khuẩn lạc E. coli dương tính beta-glucuronidaza bằng mắt thường.
• Tính toán kết quả: Người kiểm nghiệm tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc màu xanh lam xuất hiện trên màng lọc và áp dụng công thức toán học để tính toán mật độ E. coli trên một gam hoặc một mililit mẫu thử ban đầu.