Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 4991:2005 (hoàn toàn tương đương với ISO 7937:2004) quy định phương pháp chuẩn để định lượng vi khuẩn Clostridium perfringens trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Dưới đây là phần tóm tắt chi tiết và chuyên sâu các nội dung cốt lõi từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

- Phạm vi áp dụng (Điều 1)

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp chung để định lượng vi sinh vật Clostridium perfringens có trong các đối tượng sau:

• Các sản phẩm thực phẩm phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng của con người.
• Các sản phẩm thức ăn chăn nuôi dành cho động vật.
• Các mẫu môi trường xung quanh khu vực sản xuất, chế biến và xử lý thực phẩm.

Do tính chất đa dạng của các loại thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, phương pháp này có thể không hoàn toàn phù hợp cho một số sản phẩm cụ thể. Trong trường hợp đó, các phương pháp khác biệt có thể được áp dụng nếu thực sự cần thiết vì lý do kỹ thuật hoặc pháp lý.

- Tài liệu viện dẫn (Điều 2)

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, việc viện dẫn các tài liệu tiêu chuẩn sau đây là bắt buộc. Đối với các tài liệu ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu, đối với tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất:

• TCVN 6404 (ISO 7218) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật.
• TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.

- Thuật ngữ và định nghĩa (Điều 3)

Tiêu chuẩn đưa ra định nghĩa rõ ràng về đối tượng kiểm nghiệm để làm cơ sở cho việc nhận diện và khẳng định kết quả:

• Clostridium perfringens: Là loại vi khuẩn kị khí, sinh bào tử, hình que, gram dương, có khả năng khử sulfit thành sulfua.
• Trong các điều kiện quy định của tiêu chuẩn này, chúng tạo thành các khuẩn lạc đặc trưng màu đen (do kết tủa sắt sulfua) trên môi trường thạch TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine).
• Các khuẩn lạc này sau đó phải được khẳng định lại bằng các phản ứng sinh hóa đặc trưng bao gồm: không di động, có khả năng khử nitrat thành nitrit, có khả năng phân giải lactose và hóa lỏng gelatin trong môi trường giống kị khí (môi trường lactose gelatin).

- Nguyên tắc của phương pháp định lượng (Điều 4)

Phương pháp định lượng Clostridium perfringens dựa trên kỹ thuật đếm khuẩn lạc với quy trình thực hiện nghiêm ngặt qua các bước sau:

• Chuẩn bị và cấy mẫu: Sử dụng một lượng mẫu thử xác định (nếu mẫu ở dạng lỏng) hoặc một lượng huyền phù ban đầu (đối với các dạng mẫu khác), hoặc các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo của mẫu. Tiến hành cấy trộn vào môi trường chọn lọc chuyên biệt là thạch TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine).
• Phủ lớp thạch đệm: Sau khi cấy mẫu, phủ thêm một lớp thạch TSC không chứa chất chỉ thị hoặc chứa cycloserin lên trên bề mặt đĩa để tạo môi trường kị khí tối ưu, đồng thời hạn chế sự phát triển lan rộng của các khuẩn lạc.
• Ủ ấm kị khí: Tiến hành ủ các đĩa thạch trong điều kiện kị khí hoàn toàn ở nhiệt độ 37 độ C (± 1 độ C) trong khoảng thời gian từ 20 giờ đến 24 giờ.
• Đếm khuẩn lạc: Sau thời gian ủ, tiến hành đếm các khuẩn lạc đặc trưng có màu đen hoặc xám đen (do phản ứng khử sulfit tạo sắt sulfua).
• Thử nghiệm khẳng định: Chọn ngẫu nhiên một số lượng khuẩn lạc đặc trưng nhất định từ các đĩa thạch để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa khẳng định (khả năng di động, khử nitrat, phân giải lactose và hóa lỏng gelatin).
• Tính toán kết quả: Dựa trên tỷ lệ khuẩn lạc đặc trưng đã được khẳng định để tính toán số lượng Clostridium perfringens có trong một gam hoặc một mililit mẫu thử ban đầu.