Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11395:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11395:2016 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 17919:2013, quy định quy trình kỹ thuật sử dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện các loài Clostridia sinh độc tố thần kinh botulinum (BoNT) typ A, B, E và F trong chuỗi thực phẩm. Dưới đây là tóm tắt chi tiết nội dung từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

Điều 1: Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này xác định các yêu cầu kỹ thuật cụ thể đối với việc phát hiện các gen mã hóa độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F bằng phương pháp PCR. Phạm vi áp dụng bao gồm:

• Các sản phẩm dành cho sự tiêu thụ của con người (thực phẩm).
• Các sản phẩm thức ăn chăn nuôi.
• Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, chế biến và xử lý thực phẩm.
• Phương pháp này có khả năng phát hiện các chủng Clostridium botulinum, Clostridium butyricum và Clostridium baratii có mang gen sinh độc tố thần kinh tương ứng.

Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, cần viện dẫn các tài liệu cốt lõi sau đây. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu, đối với tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất:

• TCVN 7393 (ISO 22174), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu chung và định nghĩa.
• Các tiêu chuẩn liên quan đến việc chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.

Điều 3: Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn đưa ra các định nghĩa chuyên ngành quan trọng nhằm thống nhất cách hiểu và thực hiện quy trình xét nghiệm:

• Clostridia sinh độc tố thần kinh botulinum (BoNT-producing clostridia): Nhóm vi khuẩn kị khí, sinh nha bào, có khả năng sản sinh ra một hoặc nhiều loại độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E hoặc F gây liệt cơ nghiêm trọng ở người và động vật.
• Gen bont (bont gene): Các gen mã hóa cho độc tố thần kinh botulinum, bao gồm các phân typ cụ thể là bontA, bontB, bontE và bontF.
• Phản ứng chuỗi polymerase (PCR): Kỹ thuật sinh học phân tử dùng để khuếch đại một vùng DNA đích cụ thể một cách in vitro thông qua các chu kỳ nhiệt.

Điều 4: Nguyên tắc của phương pháp

Quy trình phát hiện clostridia sinh độc tố thần kinh botulinum dựa trên nguyên tắc kết hợp giữa tăng sinh vi sinh vật và phân tích sinh học phân tử:

• Tăng sinh chọn lọc: Mẫu thử được nuôi cấy trong môi trường tăng sinh kị khí thích hợp để nhân lên số lượng tế bào vi khuẩn mục tiêu và giải phóng nha bào (nếu có) trước khi tiến hành tách chiết DNA.
• Tách chiết DNA: Giải phóng DNA mạch kép từ các tế bào vi khuẩn đã được tăng sinh. Quá trình này phải đảm bảo loại bỏ tối đa các chất ức chế phản ứng PCR có tự nhiên trong mẫu thực phẩm.
• Khuếch đại PCR: Sử dụng các cặp mồi (primers) và đầu dò (probes) đặc hiệu để phát hiện sự hiện diện của các gen bontA, bontB, bontE và bontF thông qua phản ứng PCR (thường ưu tiên Real-time PCR để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu).
• Xác định kết quả: Đánh giá sự hiện diện của các gen đích dựa trên tín hiệu huỳnh quang tích lũy (đối với Real-time PCR) hoặc kích thước vạch sản phẩm điện di (đối với PCR truyền thống) so với các chứng dương và chứng âm kiểm chứng.