Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12560-2:2018 về Phân bón vi sinh vật - Xác định mật độ nấm rễ nội cộng sinh - Phần 2: Xác định khả năng cộng sinh của các chủng nấm rễ nội cộng sinh với cây trồng được ban hành nhằm quy định phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học và khả năng liên kết cộng sinh của các chủng nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza - AM) đối với bộ rễ vật chủ.

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định khả năng cộng sinh của các chủng nấm rễ nội cộng sinh có trong phân bón vi sinh vật với cây trồng chỉ thị trong điều kiện nhà lưới hoặc phòng thí nghiệm có kiểm soát. Đối tượng áp dụng bao gồm các cơ quan quản lý nhà nước, tổ chức thử nghiệm, cùng các doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh và nhập khẩu phân bón vi sinh vật tại Việt Nam.

• TCVN 12560-1: Phân bón vi sinh vật - Xác định mật độ nấm rễ nội cộng sinh - Phần 1: Phương pháp đếm bào tử.

• Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhizal Fungi - AMF): Là nhóm nấm thuộc ngành Glomeromycota, có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vỏ rễ của hầu hết các loài thực vật trên cạn, hình thành nên các cấu trúc đặc trưng như túi (vesicles), bụi (arbuscules) và sợi nấm nội rễ để thực hiện quá trình trao đổi dinh dưỡng với cây chủ.
• Khả năng cộng sinh: Là năng lực của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trong việc xâm nhiễm, thiết lập mối quan hệ cộng sinh bền vững và phát triển hệ thống sợi nấm bên trong cũng như bên ngoài rễ cây chỉ thị dưới các điều kiện môi trường tiêu chuẩn.

Phương pháp dựa trên nguyên lý gieo trồng cây chỉ thị mẫn cảm với nấm rễ (thường là cây ngô hoặc cỏ ba lá) trên giá thể vô trùng đã được lây nhiễm một lượng chế phẩm nấm rễ nội cộng sinh nhất định. Sau một thời gian nuôi cấy tiêu chuẩn, hệ thống rễ cây được thu hoạch, tiến hành xử lý hóa chất để làm trong tế bào rễ, nhuộm màu đặc trưng các cấu trúc nấm và quan sát dưới kính hiển vi quang học để xác định tỷ lệ phần trăm phân đoạn rễ bị xâm nhiễm.

• Thiết bị và dụng cụ: Kính hiển vi quang học có độ phóng đại phù hợp, buồng sinh trưởng hoặc nhà lưới kiểm soát nhiệt độ và ánh sáng, nồi hấp áp trùng để khử trùng giá thể, hệ thống bể điều nhiệt hoặc bếp đun cách thủy, lam kính, lamen, panh và kéo cắt rễ.
• Hóa chất và thuốc thử: Dung dịch kali hydroxit (KOH) nồng độ 10% dùng để làm trong tế bào rễ; dung dịch axit clohydric (HCl) nồng độ 1% dùng để axit hóa rễ trước khi nhuộm; dung dịch nhuộm chuyên dụng (như trypan xanh, acid fuchsin hoặc mực viết chuyên dụng pha trong axit lactic) để nhuộm màu các cấu trúc sợi nấm, túi và bụi.

Quy trình xác định khả năng cộng sinh của nấm rễ nội cộng sinh được tiến hành qua các bước nghiêm ngặt sau:

• Chuẩn bị giá thể và gieo trồng: Sử dụng cát thạch anh hoặc hỗn hợp đất-cát đã được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 độ C trong 60 phút để loại bỏ hoàn toàn các vi sinh vật bản địa. Hạt giống cây chỉ thị được khử trùng bề mặt bằng dung dịch chuyên dụng, sau đó gieo vào các chậu chứa giá thể đã bổ sung mẫu phân bón vi sinh vật cần kiểm tra.
• Chăm sóc và nuôi dưỡng: Cây được duy trì trong điều kiện nhà lưới hoặc phòng nuôi cấy với chế độ chiếu sáng và nhiệt độ thích hợp. Quá trình tưới nước sử dụng dung dịch dinh dưỡng đặc biệt không chứa hoặc chứa hàm lượng phốt pho cực thấp nhằm kích thích sự hình thành và phát triển của nấm rễ cộng sinh.
• Thu mẫu và xử lý rễ: Sau thời gian nuôi cấy từ 4 đến 6 tuần, tiến hành thu hoạch toàn bộ bộ rễ cây chỉ thị, rửa sạch đất cát dưới vòi nước chảy nhẹ, tránh làm tổn thương hệ rễ. Cắt rễ thành các đoạn nhỏ có chiều dài khoảng 1 cm để chuẩn bị cho bước nhuộm.
• Làm trong và nhuộm màu rễ: Ngâm các đoạn rễ trong dung dịch KOH 10% và gia nhiệt ở 90 độ C trong khoảng 15 đến 30 phút tùy thuộc vào độ cứng của rễ. Sau khi rễ đã trong suốt, rửa sạch bằng nước cất, ngâm vào dung dịch HCl 1% trong 3 đến 5 phút để axit hóa. Tiếp tục chuyển rễ sang dung dịch nhuộm ấm và giữ ở 90 độ C trong 10 đến 15 phút để thuốc nhuộm bám chặt vào cấu trúc nấm.
• Quan sát và đánh giá: Đặt các đoạn rễ đã nhuộm lên lam kính, ép nhẹ bằng lamen và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Nhận diện các cấu trúc đặc trưng của nấm rễ nội cộng sinh bao gồm sợi nấm chạy dọc trong vỏ rễ, các túi chứa lipid và các bụi phân nhánh bên trong tế bào.

Khả năng cộng sinh được biểu thị thông qua tỷ lệ nhiễm nấm rễ (ký hiệu là %R). Tỷ lệ này được tính toán dựa trên số lượng phân đoạn rễ có sự xuất hiện của cấu trúc nấm rễ nội cộng sinh chia cho tổng số phân đoạn rễ được quan sát dưới kính hiển vi, nhân với 100. Kết quả trung bình của các lần lặp lại sẽ phản ánh chính xác mức độ và khả năng cộng sinh của chủng nấm rễ trong mẫu phân bón đối với cây trồng.