Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12560-1:2018 về Phân bón vi sinh vật - Xác định mật độ nấm rễ nội cộng sinh - Phần 1: Đếm số lượng bào tử nấm nội cộng sinh bằng kỹ thuật sàng ướt, ly tâm nổi được ban hành năm 2018 bởi Bộ Khoa học và Công nghệ, quy định phương pháp chuẩn hóa nhằm xác định chính xác mật độ bào tử nấm rễ nội cộng sinh trong các sản phẩm phân bón vi sinh vật.

Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh

Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các cơ quan quản lý nhà nước, tổ chức chứng nhận hợp quy, các phòng thử nghiệm và các doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh phân bón vi sinh vật tại Việt Nam. Phạm vi điều chỉnh cụ thể bao gồm:

• Quy định phương pháp xác định mật độ nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhizal Fungi - AMF) trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật sàng ướt kết hợp ly tâm nổi.
• Áp dụng cho các loại phân bón vi sinh vật có chứa nấm rễ nội cộng sinh ký sinh bắt buộc ở dạng bào tử.
• Không áp dụng cho các nhóm vi sinh vật khác không thuộc nhóm nấm rễ nội cộng sinh hoặc các chế phẩm sinh học không dùng làm phân bón.

- Tài liệu viện dẫn và thuật ngữ chuyên ngành

• Tài liệu viện dẫn: Tiêu chuẩn này áp dụng các tài liệu viện dẫn cốt lõi bao gồm TCVN 4851 (ISO 3696) về nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích và các tiêu chuẩn liên quan đến lấy mẫu phân bón hiện hành nhằm đảm bảo tính đồng bộ và độ chính xác của kết quả thử nghiệm.
• Nấm rễ nội cộng sinh (AMF): Là nhóm nấm thuộc ngành Glomeromycota, có khả năng thiết lập mối quan hệ cộng sinh bên trong tế bào vỏ rễ của hầu hết các loài thực vật trên cạn, giúp cây trồng hấp thu nước và các chất dinh dưỡng, đặc biệt là phốt pho.
• Bào tử nấm rễ nội cộng sinh: Là cấu trúc sinh sản vô tính của nấm AMF, tồn tại độc lập trong đất hoặc giá thể, có kích thước, hình dạng và màu sắc đặc trưng tùy thuộc vào từng chi, loài.

- Nguyên tắc của phương pháp sàng ướt và ly tâm nổi

Phương pháp xác định mật độ bào tử dựa trên nguyên tắc vật lý và cơ học nghiêm ngặt nhằm tách hoàn toàn bào tử ra khỏi các thành phần giá thể hữu cơ hoặc vô cơ trong phân bón:

• Giải phóng bào tử: Mẫu phân bón vi sinh vật được hòa tan và khuấy đều trong nước để giải phóng các bào tử nấm ra khỏi liên kết với hạt giá thể.
• Sàng lọc phân đoạn (Sàng ướt): Hỗn hợp dịch mẫu được dội qua một hệ thống sàng có kích thước lỗ giảm dần (thường từ 250 µm xuống 45 µm) để giữ lại các bào tử có kích thước nằm trong khoảng này, đồng thời loại bỏ các hạt giá thể quá lớn hoặc quá nhỏ.
• Ly tâm nổi bằng dung dịch đường: Phần cặn thu được trên các sàng được chuyển vào ống ly tâm chứa dung dịch đường sucrose có tỷ trọng cao. Quá trình ly tâm giúp phân tách bào tử (nổi lên trên bề mặt dịch đường) ra khỏi các hạt đất đá, cát hoặc chất hữu cơ nặng (lắng xuống đáy).
• Thu hồi và đếm bào tử: Lớp dịch nổi chứa bào tử được gạn nhanh qua sàng nhỏ, rửa sạch đường bằng nước cất, sau đó chuyển lên đĩa petri chuyên dụng để tiến hành đếm số lượng bào tử dưới kính hiển vi soi nổi ở độ phóng đại thích hợp.

- Thiết bị, dụng cụ và hóa chất yêu cầu

Để thực hiện phép thử nghiệm đạt độ chính xác cao, phòng thử nghiệm cần trang bị đầy đủ các thiết bị và hóa chất tiêu chuẩn:

• Thiết bị chính: Kính hiển vi soi nổi có độ phóng đại từ 10x đến 80x; Máy ly tâm có rotor văng ngang, đạt tốc độ tối thiểu 2000 vòng/phút; Máy khuấy từ hoặc máy lắc cơ học; Cân phân tích có độ chính xác đến 0,01 g.
• Dụng cụ: Bộ sàng ướt bằng thép không gỉ với các kích thước lỗ sàng tiêu chuẩn (ví dụ: 500 µm, 250 µm, 106 µm, 45 µm); Đĩa đếm chuyên dụng (đĩa Petri có kẻ ô); Ống đong, cốc mỏ, ống ly tâm dung tích 50 mL.
• Hóa chất: Đường sucrose tinh khiết hóa chất; Nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương đạt tiêu chuẩn TCVN 4851.

- Quy trình tiến hành thử nghiệm chi tiết

Quy trình phân tích phải tuân thủ nghiêm ngặt các bước kỹ thuật sau để tránh làm thất thoát hoặc hư hỏng cấu trúc bào tử:

• Chuẩn bị mẫu: Cân một lượng mẫu đại diện xác định (thường khoảng 10 g đến 50 g tùy thuộc vào mật độ dự kiến của sản phẩm) và hòa vào nước cất.
• Khuấy phân tán: Sử dụng máy khuấy từ hoặc lắc cơ học trong khoảng thời gian quy định để đánh tan hoàn toàn các cục đất sét hoặc giá thể liên kết.
• Sàng lọc: Đổ dịch huyền phục qua hệ thống sàng xếp chồng lên nhau từ lớn đến nhỏ. Dùng vòi nước chảy nhẹ để rửa trôi các hạt mịn qua sàng. Thu hồi phần cặn trên các sàng có kích thước từ 45 µm đến 250 µm.
• Ly tâm lần 1 (Ly tâm nước): Chuyển toàn bộ phần cặn thu được vào ống ly tâm với nước cất, ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ phần dịch nổi chứa các chất hữu cơ nhẹ trôi nổi.
• Ly tâm lần 2 (Ly tâm đường): Thêm dung dịch sucrose vào phần cặn còn lại trong ống ly tâm, lắc đều để phân tán cặn. Tiến hành ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 1 phút. Ngay sau khi dừng máy, gạn nhanh phần dịch nổi (chứa bào tử) lên sàng 45 µm để tránh đường làm vỡ bào tử do áp suất thẩm thấu. Rửa sạch đường trên sàng bằng nước cất.
• Quan sát và đếm: Chuyển toàn bộ bào tử từ sàng vào đĩa đếm có kẻ ô. Tiến hành đếm toàn bộ số lượng bào tử sống, có hình dạng nguyên vẹn dưới kính hiển vi soi nổi.

- Công thức tính toán và biểu thị kết quả

Mật độ bào tử nấm rễ nội cộng sinh trong mẫu phân bón được tính toán dựa trên số lượng bào tử đếm được và khối lượng mẫu phân tích ban đầu:

• Công thức tính mật độ bào tử (X) tính bằng số bào tử trên một gam mẫu (bào tử/g) hoặc trên một mililít mẫu (bào tử/mL): X = A / M. Trong đó, A là tổng số bào tử đếm được dưới kính hiển vi; M là khối lượng (g) hoặc thể tích (mL) của mẫu phân bón đem phân tích.
• Kết quả cuối cùng là trị số trung bình cộng của ít nhất hai lần lặp lại thí nghiệm song song, được làm tròn đến số nguyên gần nhất. Sai lệch giữa hai lần thử song song không được vượt quá giới hạn cho phép quy định trong tiêu chuẩn.

Hiệu lực thi hành và hướng dẫn áp dụng

TCVN 12560-1:2018 có hiệu lực kể từ ngày ban hành. Tiêu chuẩn này là căn cứ kỹ thuật pháp lý quan trọng để các phòng thử nghiệm được chỉ định tiến hành đánh giá, chứng nhận hợp quy chất lượng phân bón vi sinh vật chứa nấm rễ nội cộng sinh trước khi lưu thông trên thị trường Việt Nam. Việc áp dụng đúng quy trình kỹ thuật trong tiêu chuẩn giúp bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và nâng cao hiệu quả sử dụng phân bón sinh học trong sản xuất nông nghiệp bền vững.