Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11133:2015 (ISO 22119:2011)

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11133:2015 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 22119:2011. Đây là văn bản kỹ thuật cốt lõi quy định các thuật ngữ, định nghĩa và yêu cầu chung đối với việc ứng dụng phản ứng chuỗi polymerase real-time (real-time PCR) nhằm phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Tiêu chuẩn này đóng vai trò định hướng, thống nhất phương pháp luận và đảm bảo tính chính xác, độ tin cậy cao cho các kết quả thử nghiệm sinh học phân tử tại Việt Nam.

Phạm vi áp dụng (Điều 1)

Điều 1 của tiêu chuẩn xác định rõ giới hạn và đối tượng điều chỉnh của phương pháp real-time PCR trong kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm:

• Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh truyền qua thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, bao gồm cả các mẫu lấy từ môi trường sản xuất, chế biến thực phẩm.
• Quy trình kỹ thuật tập trung vào các yêu cầu cụ thể đối với việc khuếch đại và phát hiện các trình tự axit nucleic mục tiêu (DNA hoặc RNA sau khi thực hiện phiên mã ngược).
• Phương pháp này có khả năng áp dụng rộng rãi cho nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, virus, ký sinh trùng, nấm men và nấm mốc.

Tài liệu viện dẫn (Điều 2)

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách hiệu quả và đồng bộ, người sử dụng cần kết hợp tham chiếu với các tài liệu tiêu chuẩn liên quan sau:

• TCVN 7606 (ISO 22174) - Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu chung và định nghĩa. Đây là tài liệu nền tảng bắt buộc để thiết lập một quy trình PCR chuẩn hóa từ khâu chuẩn bị mẫu đến phân tích kết quả.

Thuật ngữ và định nghĩa cốt lõi (Điều 3)

Điều 3 cung cấp hệ thống thuật ngữ chuyên ngành chuẩn hóa nhằm đảm bảo sự thống nhất trong cách hiểu và vận hành tại các phòng thí nghiệm:

• Phản ứng chuỗi polymerase real-time (Real-time PCR): Là phương pháp khuếch đại DNA mục tiêu, trong đó quá trình tích lũy sản phẩm khuếch đại được theo dõi và đo lường liên tục trong suốt chu kỳ phản ứng nhờ tín hiệu huỳnh quang phát ra.
• Chu kỳ ngưỡng (Ct - Threshold cycle): Chu kỳ phản ứng PCR mà tại đó tín hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua giới hạn nền (background level) và được hệ thống ghi nhận là có sự khuếch đại dương tính.
• Chất phát huỳnh quang (Fluorophore): Phân tử hóa học có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng ở một bước sóng nhất định và phát xạ ánh sáng ở bước sóng dài hơn, được sử dụng để đánh dấu đầu dò hoặc liên kết trực tiếp với DNA sợi kép.
• Chất dập tắt huỳnh quang (Quencher): Phân tử có chức năng làm giảm hoặc triệt tiêu cường độ phát xạ huỳnh quang của chất phát huỳnh quang khi chúng ở khoảng cách gần nhau.
• Đầu dò lai (Hybridization probe): Trình tự oligonucleotide được thiết kế đặc hiệu để liên kết với vùng DNA mục tiêu nằm giữa hai mồi, được gắn các phân tử huỳnh quang để phát hiện sản phẩm PCR một cách đặc hiệu.
• Kiểm chứng nội tại (Internal Amplification Control - IAC): Trình tự DNA kiểm chứng được đưa trực tiếp vào cùng một ống phản ứng PCR với mẫu thử nhằm xác định sự hiện diện của các chất ức chế phản ứng và kiểm soát chất lượng của toàn bộ quá trình khuếch đại.

Yêu cầu chung và nguyên tắc vận hành (Điều 4)

Điều 4 thiết lập các nguyên tắc cơ bản và yêu cầu kỹ thuật tối thiểu mà một phòng thử nghiệm real-time PCR phải tuân thủ nghiêm ngặt:

• Nguyên lý hoạt động: Dựa trên việc phát hiện và đo lường tín hiệu huỳnh quang tăng dần theo tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm PCR được tạo ra qua từng chu kỳ khuếch đại nhiệt.
• Yêu cầu về thiết bị và hóa chất: Hệ thống máy real-time PCR phải được hiệu chuẩn định kỳ về cả mặt kiểm soát nhiệt độ và khả năng đọc tín hiệu huỳnh quang. Các hóa chất sử dụng (như master mix, enzyme polymerase, dNTPs) phải đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng cho sinh học phân tử.
• Kiểm soát ngoại nhiễm: Phòng thí nghiệm phải được thiết kế theo nguyên tắc một chiều, phân chia rõ rệt các khu vực chức năng (chuẩn bị hóa chất, tách chiết DNA/RNA, và khu vực chạy máy PCR) nhằm ngăn ngừa tuyệt đối hiện tượng lây nhiễm chéo sản phẩm khuếch đại (amplicon).
• Thiết kế mồi và đầu dò: Các cặp mồi (primers) và đầu dò (probes) phải được tối ưu hóa để đảm bảo tính đặc hiệu cao nhất, không xảy ra phản ứng chéo với các loài vi sinh vật không phải mục tiêu có mặt trong mẫu thực phẩm.