Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8904:2011 (hoàn toàn tương đương với EN 12631:1999) quy định phương pháp enzym bằng cách đo phổ NAD để xác định hàm lượng axit D- và L-lactic (lactat) trong nước rau quả và các sản phẩm liên quan. Dưới đây là tóm tắt chi tiết nội dung từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này:

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng axit D-lactic và L-lactic (lactat) tổng số trong nước rau quả và các sản phẩm tương tự.
• Phương pháp này cho phép xác định riêng biệt hoặc đồng thời cả hai đồng phân quang học của axit lactic, giúp đánh giá chất lượng, độ tươi nguyên của sản phẩm, cũng như phát hiện sớm sự nhiễm khuẩn hoặc quá trình lên men không mong muốn trong sản xuất.

• Tiêu chuẩn áp dụng các tài liệu viện dẫn rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác của phép thử.
• Tài liệu viện dẫn cốt lõi là TCVN 4851 (ISO 3696) về nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích, yêu cầu sử dụng nước có chất lượng tối thiểu là loại 3 để pha chế các dung dịch thuốc thử và mẫu thử.

• Phản ứng oxy hóa khử: Axit L-lactic (lactat) được oxy hóa bởi nicotinamit adenin dinucleotit (NAD) thành pyruvat dưới sự xúc tác của enzym L-lactat dehydrogenase (L-LDH).
• Tương tự, axit D-lactic được oxy hóa thành pyruvat dưới sự xúc tác của enzym D-lactat dehydrogenase (D-LDH) với sự tham gia của NAD.
• Chuyển dịch cân bằng hóa học: Do phản ứng trên là phản ứng thuận nghịch, để đẩy phản ứng chuyển dịch hoàn toàn theo chiều tạo thành pyruvat, pyruvat sinh ra sẽ được bẫy bằng cách cho phản ứng với hydrazin trong môi trường kiềm (đệm glycylglycin-hydrazin).
• Đo quang phổ: Lượng NADH được tạo thành trong phản ứng tương đương với lượng axit L-lactic hoặc D-lactic có trong mẫu thử. Hàm lượng NADH này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang phổ tại bước sóng 340 nm (hoặc tại các vạch phổ của đèn thủy ngân ở bước sóng 334 nm hoặc 365 nm).

Tiêu chuẩn yêu cầu sử dụng các hóa chất tinh khiết phân tích và nước ít nhất đạt chất lượng loại 3 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các thuốc thử chính bao gồm:

• Dung dịch đệm glycylglycin-hydrazin: Có độ pH khoảng 9,0, chứa glycylglycin và hydrazin hydrat, được sử dụng để duy trì môi trường kiềm ổn định và bẫy pyruvat phát sinh trong phản ứng.
• Dung dịch nicotinamit adenin dinucleotit (NAD): Chuẩn bị bằng cách hòa tan NAD trong nước, dung dịch này cần được bảo quản lạnh để tránh phân hủy và đảm bảo hoạt tính.
• Huyền phù enzym L-lactat dehydrogenase (L-LDH): Enzym thu được từ cơ thỏ, có hoạt tính đặc hiệu cao đối với axit L-lactic.
• Huyền phù enzym D-lactat dehydrogenase (D-LDH): Enzym thu được từ vi khuẩn (như Lactobacillus leichmannii), có hoạt tính đặc hiệu đối với axit D-lactic.
• Dung dịch chuẩn axit L-lactic và D-lactic: Dùng để kiểm tra hiệu năng của hệ thống enzym, độ chính xác của thiết bị đo phổ và thiết lập đường chuẩn khi cần thiết.