Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13046:2020 về Thức ăn chăn nuôi - Phân lập và định lượng Lactobacillus spp. được ban hành năm 2020 bởi Bộ Khoa học và Công nghệ, quy định phương pháp chuẩn hóa nhằm phát hiện, phân lập và xác định số lượng vi khuẩn Lactobacillus spp. trong các sản phẩm thức ăn chăn nuôi.

Phạm vi và đối tượng áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các phòng thử nghiệm vi sinh vật, các cơ sở sản xuất, kinh doanh thức ăn chăn nuôi, và các cơ quan kiểm tra chất lượng nhà nước. Đối tượng áp dụng trực tiếp là các loại thức ăn chăn nuôi, thức ăn hỗn hợp, nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, đặc biệt là các sản phẩm có bổ sung chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn có lợi thuộc chi Lactobacillus.

Nguyên tắc của phương pháp phân lập và định lượng

• Phương pháp dựa trên việc nuôi cấy định lượng các vi sinh vật trên môi trường chọn lọc chuyên biệt cho Lactobacillus (thường là môi trường MRS agar).
• Quá trình ủ ấm được thực hiện trong điều kiện kỵ khí hoặc vi hiếu khí ở nhiệt độ thích hợp (thường là 37 độ C) trong khoảng thời gian từ 48 giờ đến 72 giờ để kích thích sự phát triển của khuẩn lạc.
• Xác định số lượng dựa trên việc đếm các khuẩn lạc đặc trưng và tiến hành các thử nghiệm khẳng định sinh hóa cần thiết.

Thiết bị, dụng cụ và môi trường nuôi cấy

• Thiết bị và dụng cụ: Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm vi sinh tiêu chuẩn bao gồm tủ ấm kỵ khí, nồi hấp tiệt trùng, máy dập mẫu (homogenizer), kính hiển vi quang học, và các dụng cụ thủy tinh vô trùng.
• Môi trường và thuốc thử: Sử dụng môi trường MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) agar hoặc các môi trường tương đương có bổ sung chất ức chế tác nhân ngoại nhiễm. Dung dịch pha loãng mẫu thông thường là nước muối peptone sinh lý vô trùng. Thuốc thử cho phản ứng nhuộm Gram và thử nghiệm catalase.

Quy trình thực hiện chi tiết

• Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành cân và đồng nhất một lượng mẫu thử xác định với dung dịch pha loãng theo tỷ lệ quy định để tạo thành dung dịch huyền phù ban đầu.
• Pha loãng mẫu: Thực hiện các bước pha loãng thập phân liên tiếp từ dung dịch huyền phù ban đầu để đạt được nồng độ vi sinh vật thích hợp cho việc đếm khuẩn lạc.
• Cấy mẫu và ủ ấm: Chuyển một thể tích dịch pha loãng xác định vào các đĩa thạch MRS bằng phương pháp cấy trải hoặc cấy sâu. Tiến hành ủ các đĩa thạch trong bình ủ kỵ khí hoặc tủ ấm kỵ khí ở nhiệt độ 37 độ C trong thời gian từ 48 giờ đến 72 giờ.
• Đếm khuẩn lạc: Chọn các đĩa thạch có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng tối ưu (từ 30 đến 300 khuẩn lạc) để tiến hành đếm và ghi nhận kết quả.

Thử nghiệm khẳng định sinh hóa

• Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch để tiến hành nhuộm Gram và kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi. Vi khuẩn Lactobacillus spp. điển hình là trực khuẩn Gram dương, không sinh nha bào.
• Thực hiện thử nghiệm catalase: Lactobacillus spp. cho kết quả catalase âm tính (không sủi bọt khí khi tiếp xúc với dung dịch hydro peroxide).

Tính toán và biểu thị kết quả

Số lượng Lactobacillus spp. có trong một gam hoặc một mililit mẫu thử được tính toán dựa trên số lượng khuẩn lạc khẳng định đếm được trên các đĩa đã chọn và hệ số pha loãng tương ứng. Kết quả cuối cùng được biểu thị dưới dạng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên mỗi gam (CFU/g) hoặc mỗi mililit (CFU/mL) mẫu thử.

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13046:2020 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày ban hành công bố, đóng vai trò là căn cứ kỹ thuật thống nhất để đánh giá chất lượng và hàm lượng vi sinh vật có lợi trong thức ăn chăn nuôi lưu thông trên thị trường Việt Nam.