Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7930:2008 (hoàn toàn tương đương với EN 12955:1999) quy định phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin B1 và tổng aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các loại ngũ cốc, quả có vỏ cứng và các sản phẩm chế biến từ chúng. Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ chính xác và độ nhạy cao nhờ kết hợp kỹ thuật làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có dẫn xuất sau cột.

Phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn (Điều 1)

• Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các loại ngũ cốc, quả có vỏ cứng (như lạc, hạt điều, hạnh nhân...) và các sản phẩm phụ phẩm, sản phẩm chế biến từ các nguyên liệu này.
• Phương pháp này đã được kiểm chứng và xác nhận giá trị sử dụng đối với hàm lượng aflatoxin B1 từ 0,1 microgam trên kilogam (mcg/kg) trở lên và đối với tổng hàm lượng aflatoxin (B1, B2, G1, G2) từ 0,2 mcg/kg trở lên.

Tài liệu viện dẫn (Điều 2)

• Các tài liệu viện dẫn trong tiêu chuẩn là vô cùng cần thiết cho việc áp dụng phương pháp. Trong đó, tài liệu quan trọng nhất là TCVN 4851 (ISO 3696) về nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích, yêu cầu sử dụng nước có chất lượng tối thiểu là loại 3 hoặc loại tinh khiết hơn để đảm bảo không gây nhiễu kết quả phân tích.

Nguyên tắc của phương pháp phân tích (Điều 3)

Quy trình phân tích aflatoxin theo tiêu chuẩn này dựa trên các bước kỹ thuật cốt lõi sau:

• Chiết xuất mẫu: Phần mẫu thử được chiết bằng hỗn hợp dung môi metanol và nước. Tỷ lệ dung môi được tối ưu hóa để hòa tan tối đa các aflatoxin có trong nền mẫu ngũ cốc hoặc quả có vỏ.
• Lọc và pha loãng: Dịch chiết sau khi thu được sẽ được lọc qua giấy lọc, sau đó pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat (PBS) hoặc nước để đưa về môi trường pH và dung môi thích hợp trước khi cho qua cột ái lực miễn dịch.
• Làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch (IAC): Dịch chiết đã pha loãng được cho chảy qua cột ái lực miễn dịch có chứa các kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin B1, B2, G1 và G2. Các aflatoxin sẽ liên kết chọn lọc với kháng thể, trong khi các tạp chất khác bị rửa trôi khỏi cột bằng nước hoặc dung dịch đệm.
• Giải hấp phụ (Rửa giải): Các aflatoxin liên kết trên cột được giải hấp phụ bằng dung môi metanol (hoặc axetonitril tùy thuộc vào hướng dẫn của nhà sản xuất cột) để thu hồi hoàn toàn lượng aflatoxin vào bình định mức.
• Xác định bằng HPLC: Hàm lượng aflatoxin được định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng đầu dò huỳnh quang (FLD). Do aflatoxin B1 và G1 có cường độ huỳnh quang yếu trong pha động thông thường, quá trình dẫn xuất hóa sau cột (bằng iot, brom hoặc tế bào điện hóa) là bắt buộc để chuyển hóa chúng thành các dẫn xuất có cường độ huỳnh quang mạnh hơn, giúp tăng độ nhạy và giới hạn phát hiện của thiết bị.

Thuốc thử và các chất chuẩn yêu cầu (Điều 4)

Tiêu chuẩn quy định nghiêm ngặt về chất lượng của các loại hóa chất và chất chuẩn sử dụng nhằm đảm bảo tính đồng nhất và độ lặp lại của phép đo:

• Hóa chất cơ bản: Tất cả các hóa chất sử dụng phải thuộc loại tinh khiết phân tích hoặc dùng cho HPLC. Bao gồm metanol, axetonitril, nước cất siêu tinh khiết, muối natri clorua (NaCl), và các thành phần pha dung dịch đệm phosphat (PBS).
• Chất chuẩn aflatoxin: Sử dụng các chất chuẩn tinh khiết của aflatoxin B1, B2, G1 và G2. Các chất chuẩn này phải được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (dưới 0 độ C) và tránh ánh sáng trực tiếp để ngăn ngừa sự phân hủy quang học.
• Dung dịch chuẩn gốc và chuẩn làm việc: Quy trình chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc và các dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp phải được thực hiện chính xác bằng cách hòa tan chất chuẩn trong dung môi thích hợp (thường là axetonitril hoặc metanol). Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc phải được xác định bằng phép đo phổ hấp thụ tử ngoại (UV) trước khi pha loãng thành các điểm chuẩn dựng đường chuẩn HPLC.
• Thuốc thử dẫn xuất hóa: Tùy thuộc vào hệ thống dẫn xuất sau cột được lựa chọn, thuốc thử có thể là dung dịch iot (nếu dùng hệ thống dẫn xuất nhiệt/iot) hoặc nguồn brom sinh ra từ kali bromua (nếu dùng tế bào điện hóa Kobra cell).