Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 5164:2008 (EN 14122:2003)

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 5164:2008 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn Châu Âu EN 14122:2003. Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin B1 trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đây là một phương pháp phân tích hiện đại, có độ chính xác và độ lặp lại cao, được áp dụng rộng rãi trong các phòng kiểm nghiệm thực phẩm tại Việt Nam và quốc tế.

Điều 1: Phạm vi áp dụng

Điều khoản này xác định rõ giới hạn và đối tượng áp dụng của phương pháp phân tích:

• Phương pháp này áp dụng để xác định hàm lượng vitamin B1 có trong các loại thực phẩm khác nhau nhằm phục vụ công tác kiểm nghiệm và công bố chất lượng sản phẩm.
• Hàm lượng vitamin B1 trong mẫu được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau khi chuyển hóa thiamin thành thiochrom bằng phản ứng oxy hóa.
• Kết quả phân tích vitamin B1 được tính toán và biểu thị dưới dạng thiamin clorua hydroclorua.

Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, các tài liệu viện dẫn sau đây là cực kỳ cần thiết. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu, đối với các tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất:

• TCVN 4851 (ISO 3696) về Nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp

Nguyên tắc cốt lõi của phương pháp xác định vitamin B1 bằng HPLC bao gồm các bước xử lý mẫu và phân tích hóa lý nghiêm ngặt:

• Thủy phân mẫu: Vitamin B1 (thiamin) trong mẫu thực phẩm được giải phóng bằng cách thủy phân trong môi trường axit (thường sử dụng axit clohydric hoặc axit sunfuric) kết hợp với xử lý bằng enzym (như diastase hoặc các enzym phosphatase phù hợp khác) để cắt đứt các liên kết phosphat của thiamin phosphat, chuyển toàn bộ về dạng thiamin tự do.
• Phản ứng oxy hóa tạo thiochrom: Thiamin tự do sau khi chiết xuất được oxy hóa thành thiochrom. Phản ứng oxy hóa này có thể được thực hiện trước khi bơm vào cột sắc ký (pre-column derivatization) hoặc sau khi ra khỏi cột sắc ký (post-column derivatization) bằng cách sử dụng chất oxy hóa mạnh như kali fericyanua trong môi trường kiềm.
• Phân tích sắc ký: Thiochrom tạo thành được tách riêng biệt bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột pha đảo (reverse phase).
• Phát hiện và định lượng: Sử dụng đầu dò huỳnh quang (fluorescence detector) để đo cường độ huỳnh quang của thiochrom ở bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ đặc trưng, từ đó tính toán hàm lượng vitamin B1 dựa trên đường chuẩn của chất chuẩn thiamin clorua hydroclorua.

Điều 4: Hóa chất và thuốc thử

Tiêu chuẩn quy định nghiêm ngặt về độ tinh khiết của hóa chất sử dụng để đảm bảo tính chính xác của phép đo. Tất cả các hóa chất phải là loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng phải đạt tiêu chuẩn loại 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696):

• Hóa chất cơ bản: Axit clohydric (HCl), natri hydroxit (NaOH), natri axetat, metanol dùng cho HPLC, và các dung môi pha động khác.
• Chất oxy hóa: Kali fericyanua (potassium ferricyanide) dùng để chuẩn bị dung dịch oxy hóa thiamin thành thiochrom.
• Chế phẩm enzym: Diastase hoặc các enzym có hoạt tính phosphatase tương đương để thủy phân các este phosphat của thiamin.
• Chất chuẩn: Thiamin clorua hydroclorua chuẩn có độ tinh khiết đã biết để pha chế các dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn làm việc phục vụ cho việc xây dựng đường chuẩn sắc ký.