Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5164:2018 (hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn châu Âu EN 14122:2014) quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin B1 trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này cho phép định lượng chính xác hàm lượng thiamin tổng số, bao gồm cả các dạng dẫn xuất phosphoryl hóa của thiamin có trong các loại mẫu thực phẩm khác nhau.

Phạm vi áp dụng (Điều 1)

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin B1 (thiamin) trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Đối tượng áp dụng bao gồm các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm nghiệm thực phẩm, các doanh nghiệp sản xuất, chế biến thực phẩm và các tổ chức chứng nhận chất lượng liên quan.
• Hàm lượng vitamin B1 trong mẫu thử được xác định và biểu thị dưới dạng thiamin clorua hydroclorid.

Tài liệu viện dẫn (Điều 2)

• Các tài liệu viện dẫn trong tiêu chuẩn này là bộ phận không thể tách rời khi áp dụng TCVN 5164:2018. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu; đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

Nguyên tắc của phương pháp (Điều 3)

• Thủy phân mẫu: Vitamin B1 (thiamin) được chiết ra khỏi mẫu thực phẩm bằng cách thủy phân trong môi trường axit (thường sử dụng dung dịch axit clohydric hoặc axit sunfuric loãng) kết hợp với xử lý bằng enzym (như takadiastase hoặc amylase có hoạt tính phosphatase) để giải phóng thiamin tự do từ các dạng liên kết phosphat (thiamin monophosphat, thiamin pyrophosphat và thiamin triphosphat).
• Oxy hóa tạo thiochrom: Thiamin tự do sau khi chiết xuất được oxy hóa thành thiochrom - một hợp chất có khả năng phát huỳnh quang mạnh. Quá trình oxy hóa này thường được thực hiện bằng cách sử dụng kali fericyanua trong môi trường kiềm (natri hydroxid). Quá trình oxy hóa có thể được thực hiện trước cột (pre-column) hoặc sau cột (post-column) sắc ký.
• Tách và định lượng bằng HPLC: Thiochrom tạo thành được tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo và được định lượng bằng detector huỳnh quang với bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ thích hợp.

Hóa chất và thuốc thử (Điều 4)

• Yêu cầu chung: Tất cả các hóa chất, thuốc thử được sử dụng phải thuộc loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải là nước dùng cho HPLC hoặc nước có chất lượng tương đương.
• Chất chuẩn: Thiamin hydroclorid chuẩn (độ tinh khiết đã biết) được bảo quản tránh ánh sáng và độ ẩm để đảm bảo tính chính xác khi dựng đường chuẩn.
• Dung dịch axit và kiềm: Dung dịch axit clohydric (HCl) hoặc axit sunfuric (H2SO4) dùng cho quá trình thủy phân; dung dịch natri hydroxid (NaOH) dùng để điều chỉnh pH và tạo môi trường kiềm cho phản ứng oxy hóa.
• Chế phẩm enzym: Các enzym có hoạt tính phosphatase (ví dụ: takadiastase, diastase, hoặc acid phosphatase) để phân hủy các liên kết phosphat của thiamin. Cần kiểm tra hoạt tính của enzym và đảm bảo enzym không chứa lượng thiamin đáng kể gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
• Chất oxy hóa: Kali fericyanua (kali hexacyanoferrat (III)) dùng để chuẩn bị dung dịch oxy hóa thiamin thành thiochrom.
• Pha động cho HPLC: Hỗn hợp dung dịch đệm và dung môi hữu cơ (như methanol hoặc acetonitril) được lọc và đuổi khí trước khi sử dụng để chạy sắc ký.

Hiệu lực thi hành

TCVN 5164:2018 có hiệu lực kể từ ngày ban hành và thay thế cho các tiêu chuẩn cũ hơn về cùng nội dung. Việc áp dụng tiêu chuẩn này giúp thống nhất phương pháp thử nghiệm, đảm bảo tính chính xác, độ lặp lại và độ tái lập của kết quả phân tích vitamin B1 trong thực phẩm phục vụ công tác kiểm nghiệm và quản lý chất lượng.