Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8978:2011

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8978:2011 (hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn châu Âu EN 14131:2003) quy định phương pháp xác định hàm lượng folat trong thực phẩm bằng phép thử vi sinh. Dưới đây là tóm tắt chi tiết và chuyên sâu nội dung từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này, bao gồm phạm vi áp dụng, tài liệu viện dẫn, nguyên tắc cốt lõi của phương pháp và các yêu cầu nghiêm ngặt về hóa chất, thuốc thử cũng như chủng vi sinh vật kiểm nghiệm.

1. Phạm vi áp dụng (Điều 1)

Điều 1 xác định rõ giới hạn, đối tượng và mục đích áp dụng của phương pháp thử nghiệm:

• Đối tượng áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng folat tổng số trong các loại thực phẩm bằng phép thử vi sinh.
• Khái niệm folat: Folat được hiểu là các hợp chất có hoạt tính sinh học tương tự như axit folic (axit pteroylglutamic), bao gồm cả các dạng folat tự nhiên có trong thực phẩm (thường ở dạng polyglutamat) và axit folic tổng hợp được bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm tăng cường dinh dưỡng.
• Khả năng ứng dụng: Phương pháp này được thiết kế để phù hợp với nhiều nền mẫu thực phẩm đa dạng, từ các sản phẩm nông sản, thực phẩm chế biến thông thường cho đến các sản phẩm dinh dưỡng đặc biệt, sữa công thức và thực phẩm chức năng.

2. Tài liệu viện dẫn (Điều 2)

Điều 2 quy định các tài liệu viện dẫn là cơ sở kỹ thuật bắt buộc và không thể tách rời khi áp dụng tiêu chuẩn này:

• Các tài liệu viện dẫn bao gồm các tiêu chuẩn quốc tế hoặc quốc gia liên quan đến chất lượng nước dùng trong phòng thử nghiệm phân tích, các hướng dẫn chung về an toàn sinh học và kỹ thuật thực hành vi sinh vật học đường.
• Đối với các tài liệu viện dẫn có ghi năm công bố, các bên áp dụng phải sử dụng đúng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố, phiên bản mới nhất (bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung) sẽ được áp dụng.

3. Nguyên tắc của phương pháp (Điều 3)

Điều 3 mô tả chi tiết nguyên lý khoa học của phép thử vi sinh để định lượng folat, bao gồm các giai đoạn then chốt sau:

• Quá trình giải phóng và chiết xuất folat: Folat liên kết trong cấu trúc thực phẩm được giải phóng bằng phương pháp chiết xuất nhiệt (thủy phân bằng nhiệt trong dung dịch đệm thích hợp). Sau đó, dịch chiết được xử lý bằng các enzym đặc hiệu. Enzym conjugase (deconjugase) được sử dụng để thủy phân các chuỗi polyglutamat của folat tự nhiên thành các dạng monoglutamat hoặc diglutamat, giúp vi sinh vật kiểm nghiệm có thể hấp thu và sử dụng được. Đối với các nền mẫu giàu tinh bột hoặc protein, việc bổ sung thêm enzym amylase và protease là bắt buộc để phá vỡ liên kết và giải phóng hoàn toàn folat.
• Cơ chế sinh trưởng của vi sinh vật chỉ thị: Dịch chiết sau khi xử lý enzym được pha loãng và thêm vào môi trường nuôi cấy đặc hiệu hoàn toàn thiếu folat nhưng chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết khác cho sự phát triển của vi sinh vật.
• Đo lường sự phát triển: Vi sinh vật kiểm nghiệm được cấy vào hỗn hợp. Sự phát triển của vi sinh vật tỷ lệ thuận với lượng folat có trong dịch chiết mẫu.
• Xác định kết quả: Sự phát triển của vi sinh vật được đo bằng phương pháp đo độ đục (đo quang phổ) hoặc phương pháp đo lượng axit sinh ra (chuẩn độ). Kết quả thu được từ mẫu thử sẽ được so sánh trực tiếp với đường chuẩn được xây dựng từ các nồng độ axit folic chuẩn đã biết để tính toán ra hàm lượng folat tổng số trong mẫu ban đầu.

4. Hóa chất, thuốc thử và chủng vi sinh vật (Điều 4)

Điều 4 đưa ra các yêu cầu kỹ thuật cực kỳ nghiêm ngặt đối với tất cả các nguyên liệu đầu vào nhằm đảm bảo độ lặp lại và độ tái lập của phép thử:

• Yêu cầu về nước và hóa chất: Chỉ sử dụng các hóa chất tinh khiết phân tích và nước dùng cho phân tích phòng thử nghiệm (tối thiểu là nước loại 2 hoặc tương đương) hoàn toàn không chứa vết folat hoặc các chất gây ức chế/kích thích sự phát triển của vi sinh vật.
• Chủng vi sinh vật kiểm nghiệm: Tiêu chuẩn chỉ định sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus (ví dụ: ATCC 7469 hoặc chủng tương đương). Quy trình bảo quản chủng, cấy truyền định kỳ và chuẩn bị dịch pelet tế bào trước khi thử nghiệm phải tuân thủ nghiêm ngặt để giữ nguyên độc lực và độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với folat.
• Môi trường nuôi cấy thử nghiệm (Folate Assay Medium): Môi trường này phải được chuẩn bị từ các thành phần hóa chất tinh khiết hoặc sử dụng môi trường thương mại pha sẵn đạt chuẩn. Môi trường phải đảm bảo không chứa bất kỳ vết folat nào nhưng phải cung cấp đầy đủ axit amin, vitamin khác, muối khoáng và nguồn cacbon cho vi khuẩn.
• Dung dịch chuẩn axit folic: Dung dịch chuẩn gốc phải được chuẩn bị từ chất chuẩn axit folic có độ tinh khiết cao đã biết trước hàm lượng. Do folat rất nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ, các dung dịch chuẩn phải được bảo quản trong các dụng cụ thủy tinh tối màu, tránh ánh sáng trực tiếp và lưu trữ ở nhiệt độ lạnh theo đúng quy định để tránh phân hủy.
• Các chế phẩm enzym: Các enzym sử dụng trong quá trình thủy phân (như conjugase từ huyết thanh gà, tụy lợn, hoặc các nguồn tương đương, cùng với amylase và protease) phải được kiểm tra hoạt tính hoạt lực. Đồng thời, phải tiến hành thử nghiệm mẫu trắng enzym để xác định và hiệu chỉnh lượng folat ngoại lai (nếu có) có trong các chế phẩm enzym này, tránh làm sai lệch kết quả phân tích cuối cùng.