1. Phạm vi áp dụng và đối tượng thực hiện

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-13:2005 quy định quy trình chẩn đoán bệnh gan tụy do Parvovirus (Hepatopancreatic Parvovirus - HPV) ở tôm. Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm dịch động vật thủy sản, và các cơ sở nuôi trồng thủy sản nhằm phát hiện và kiểm soát dịch bệnh trên các đối tượng tôm nuôi, đặc biệt là tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).

2. Đặc điểm dịch tễ và triệu chứng lâm sàng của bệnh

Bệnh gan tụy do Parvovirus (HPV) gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng và tỷ lệ sống của tôm. Các dấu hiệu lâm sàng và dịch tễ học đặc trưng bao gồm:

• Triệu chứng lâm sàng: Tôm nhiễm bệnh thường có biểu hiện chậm lớn, còi cọc, kích thước không đồng đều trong cùng một ao nuôi. Gan tụy của tôm bị teo nhỏ, có màu sắc nhợt nhạt hoặc chuyển sang màu trắng xám, vỏ tôm mềm và dễ bị bám bẩn bởi các sinh vật ngoại ký sinh.
• Đặc điểm dịch tễ: Bệnh có khả năng lây truyền theo cả chiều dọc (từ tôm bố mẹ sang tôm con qua trứng) và chiều ngang (qua nguồn nước hoặc do ăn phải tôm bệnh, vật chủ trung gian truyền bệnh). Bệnh xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của tôm, từ tôm giống (postlarvae) đến tôm thương phẩm.

3. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng và kiểm tra bệnh thể

Quy trình chẩn đoán theo tiêu chuẩn TCVN 8710-13:2005 hướng dẫn chi tiết các bước kiểm tra đại thể và vi thể:

• Kiểm tra đại thể: Quan sát trực tiếp các dấu hiệu bên ngoài của tôm như tốc độ tăng trưởng, màu sắc gan tụy, tình trạng vỏ và các tổn thương vật lý khác.
• Phương pháp mô bệnh học (Histopathology): Đây là phương pháp truyền thống có độ chính xác cao để xác định bệnh. Mẫu gan tụy được cố định bằng dung dịch Davidson, tiến hành cắt lát mỏng và nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E). Kết quả dương tính được xác định khi phát hiện các thể bao (inclusion bodies) hình tròn, bắt màu base (basophilic) nằm trong nhân tế bào biểu mô ống gan tụy, làm nhân tế bào phình to và đẩy hạch nhân về phía màng nhân.

4. Phương pháp chẩn đoán bằng sinh học phân tử (PCR)

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để phát hiện nhanh và chính xác sự hiện diện của DNA Parvovirus ở tôm với các bước thực hiện nghiêm ngặt:

• Chuẩn bị mẫu và tách chiết DNA: Mẫu mô gan tụy của tôm được thu thập và bảo quản trong cồn 95% hoặc giữ đông lạnh ở nhiệt độ âm 20 độ C. Tiến hành tách chiết DNA tổng số bằng các bộ kit thương mại hoặc phương pháp truyền thống đảm bảo độ tinh sạch cao.
• Phản ứng khuếch đại gen (PCR): Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen mục tiêu của Parvovirus. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR phải được thiết lập chính xác theo hướng dẫn của tiêu chuẩn bao gồm các giai đoạn: biến tính ban đầu, các chu kỳ lặp lại (biến tính, bắt cặp, kéo dài) và giai đoạn kéo dài cuối cùng.
• Điện di và đọc kết quả: Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được điện di trên gel agarose, nhuộm bằng chất phát quang và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả được đánh giá dựa trên sự xuất hiện của vạch DNA có kích thước tương ứng với kích thước của đoạn gen mục tiêu so với mẫu đối chứng dương và thang chuẩn DNA.

5. Quy định về lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

Để đảm bảo độ chính xác của kết quả chẩn đoán, quy trình lấy mẫu và bảo quản phải tuân thủ các yêu cầu kỹ thuật sau:

• Yêu cầu về mẫu: Mẫu tôm phải còn sống hoặc mới chết (không quá 2 giờ). Số lượng mẫu lấy tùy thuộc vào kích cỡ tôm và mục đích kiểm tra (giám sát định kỳ hoặc chẩn đoán khi có dịch bệnh).
• Bảo quản mẫu: Đối với phương pháp PCR, mẫu gan tụy hoặc nguyên con (đối với tôm nhỏ) phải được ngâm ngay vào cồn 95% với tỷ lệ thể tích cồn gấp ít nhất 5 đến 10 lần thể tích mẫu, hoặc bảo quản lạnh sâu. Đối với phương pháp mô bệnh học, mẫu phải được cố định trong dung dịch Davidson trong vòng 24 đến 48 giờ trước khi chuyển sang cồn 70%.
• Vận chuyển mẫu: Mẫu bệnh phẩm phải được đóng gói kín trong các lọ nhựa chịu lực, dán nhãn đầy đủ thông tin (ký hiệu mẫu, ngày lấy, địa điểm, người lấy mẫu) và vận chuyển nhanh chóng đến phòng thí nghiệm trong thùng cách nhiệt.

6. Kết luận và khuyến nghị xử lý dịch bệnh

Dựa trên kết quả chẩn đoán từ các phương pháp trên, cơ quan chuyên môn đưa ra kết luận cuối cùng về tình trạng nhiễm bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm:

• Kết luận dương tính: Khi mẫu thử cho kết quả dương tính với phương pháp PCR hoặc phát hiện thể bao đặc trưng qua kiểm tra mô bệnh học.
• Biện pháp xử lý: Khi phát hiện ao nuôi nhiễm bệnh, cần thực hiện ngay các biện pháp cách ly, tiêu độc khử trùng nguồn nước và dụng cụ nuôi. Tuyệt đối không xả thải nước ao bệnh ra môi trường xung quanh khi chưa được xử lý triệt để nhằm ngăn chặn sự lây lan của virus sang các vùng nuôi lân cận.