Tóm tắt Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8710-3:2011 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-3:2011 do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định và Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Dưới đây là nội dung tóm tắt chi tiết và chuyên sâu từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này, quy định các bước khởi đầu và chuẩn bị nền tảng cho quy trình chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm.

Điều 1: Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định chi tiết quy trình chẩn đoán bệnh đốm trắng (White Spot Disease - WSD) ở tôm nuôi thuộc họ tôm he (Penaeidae) như tôm sú (Penaeus monodon), tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei). Quy trình chẩn đoán được thực hiện thông qua các phương pháp lâm sàng (quan sát triệu chứng bên ngoài) kết hợp với các phương pháp sinh học phân tử tiên tiến bao gồm phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và phương pháp Real-time PCR. Tiêu chuẩn này là căn cứ pháp lý và kỹ thuật áp dụng cho các cơ sở kiểm dịch động vật thủy sản, các phòng thử nghiệm bệnh thủy sản và các tổ chức, cá nhân thực hiện công tác chẩn đoán, giám sát dịch bệnh trên tôm.

Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác và đồng bộ, cần viện dẫn đến tài liệu cốt lõi sau đây. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu; đối với các tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có):

• TCVN 8710-1:2011: Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 1: Yêu cầu chung đối với phòng thử nghiệm bệnh thủy sản. Đây là tài liệu bắt buộc để đảm bảo phòng thử nghiệm đạt chuẩn về an toàn sinh học, bố trí mặt bằng và kiểm soát nhiễm chéo trước khi tiến hành chẩn đoán bệnh đốm trắng.

Điều 3: Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn đưa ra các định nghĩa khoa học chính xác nhằm thống nhất nhận thức về tác nhân gây bệnh:

• Bệnh đốm trắng (White Spot Disease - WSD): Là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm ở tôm do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) gây ra. Bệnh đặc trưng bởi sự xuất hiện của các đốm trắng dưới vỏ carapax của tôm, gây tỷ lệ tử vong cực cao (lên đến 100% trong vòng 3 đến 10 ngày kể từ khi xuất hiện dấu hiệu lâm sàng).
• Virus gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV): Là loại virus có cấu trúc DNA mạch kép, thuộc chi Whispovirus, họ Nimaviridae. Virus này có độc lực rất mạnh, tấn công và hủy hoại các tế bào có nguồn gốc từ lá phôi ngoài và lá phôi trung như biểu bì dưới vỏ, tuyến anten, mang, dạ dày và các mô liên kết của tôm.

Điều 4: Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và nguyên liệu

Để đảm bảo độ chính xác và độ nhạy của quy trình chẩn đoán, phòng thử nghiệm phải được trang bị đầy đủ các thiết bị, dụng cụ và hóa chất chuyên dụng đạt tiêu chuẩn chất lượng cao:

1. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm:

• Máy nhân gen PCR (Thermal Cycler) hoặc máy Real-time PCR: Thiết bị cốt lõi dùng để khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu của virus WSSV.
• Hệ thống điện di gel agarose: Bao gồm bể chạy điện di, bộ nguồn ổn định dòng điện và máy đọc gel (hoặc đèn soi tia cực tím UV) để phát hiện và chụp ảnh các vạch sản phẩm PCR.
• Máy ly tâm tốc độ cao: Đạt tốc độ tối thiểu 12.000 vòng/phút, có tích hợp hệ thống làm lạnh để phục vụ quá trình tách chiết DNA và chuẩn bị phản ứng PCR mà không làm phân hủy mẫu.
• Tủ an toàn sinh học cấp II: Đảm bảo môi trường vô trùng, bảo vệ kỹ thuật viên khỏi các tác nhân lây nhiễm và ngăn ngừa hiện tượng nhiễm chéo giữa các mẫu bệnh phẩm.
• Các thiết bị hỗ trợ khác: Máy lắc trộn (vortex), tủ ấm, bể điều nhiệt, cân phân tích độ chính xác cao, máy đo quang phổ (để kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau tách chiết).
• Dụng cụ tiêu hao vô trùng: Micropipet các dải thể tích khác nhau, đầu tip có màng lọc ngăn ngừa khí dung (aerosol), ống nghiệm Eppendorf (loại 0.2 ml, 1.5 ml và 2.0 ml) không chứa enzyme phân hủy nuclease.

2. Hóa chất và nguyên liệu sinh học:

• Hóa chất tách chiết DNA: Sử dụng các bộ kit tách chiết thương mại hoặc các hóa chất truyền thống (như CTAB, Phenol-Chloroform) đảm bảo thu hồi tối đa DNA của virus từ các mô đích của tôm (như mang, chân bơi, biểu bì).
• Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Enzyme Taq DNA polymerase hoạt tính cao, đệm phản ứng PCR (PCR buffer), hỗn hợp dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) và nước cất không chứa nuclease (nuclease-free water).
• Các cặp mồi (primers) đặc hiệu: Các đoạn oligonucleotide được thiết kế chuyên biệt để nhận diện và liên kết với vùng gen bảo tồn của WSSV trong phản ứng PCR thường hoặc Real-time PCR.
• Hóa chất điện di: Bột Agarose tinh khiết, dung dịch đệm điện di (TAE hoặc TBE), chất nhuộm DNA (như Ethidium bromide hoặc các chất nhuộm huỳnh quang an toàn thế hệ mới) và chất đệm nạp mẫu (loading dye) kèm thang chuẩn DNA (DNA ladder) để so sánh kích thước vạch sản phẩm.
• Mẫu kiểm chứng (Controls): Bao gồm mẫu kiểm chứng dương (DNA của WSSV đã được xác định hoặc plasmid chứa đoạn gen đích) và mẫu kiểm chứng âm (nước cất không chứa nuclease hoặc DNA tách chiết từ tôm khỏe mạnh, sạch bệnh) để kiểm soát chất lượng của từng mẻ phản ứng.