Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8710-2:2011

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8710-2:2011 do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định và Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis - VNN) ở cá biển, một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây tổn thất kinh tế lớn cho ngành nuôi trồng thủy sản biển.

1. Phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh (VNN) áp dụng cho các đối tượng cá biển nuôi, đặc biệt là các loài cá có giá trị kinh tế cao như cá song (cá mú), cá vược (cá chẽm), cá giò (cá bớp) và một số loài cá biển khác trong các giai đoạn phát triển từ cá bột, cá hương, cá giống đến cá thịt.

2. Thuật ngữ và định nghĩa liên quan đến bệnh VNN

• Bệnh hoại tử thần kinh (VNN): Là bệnh truyền nhiễm do virus thuộc họ Nodaviridae, chi Betanodavirus gây ra. Virus này tấn công vào hệ thần kinh trung ương (não và võng mạc mắt) của cá, gây ra các tổn thương nghiêm trọng và dẫn đến tử vong nhanh chóng.
• Betanodavirus: Là virus không có vỏ bọc, cấu trúc hình khối đa diện đối xứng, chứa hệ gen RNA sợi đơn phân đoạn (gồm đoạn RNA1 và RNA2).

3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong chẩn đoán

Để thực hiện quy trình chẩn đoán bệnh VNN theo tiêu chuẩn, phòng thử nghiệm cần được trang bị đầy đủ các thiết bị và hóa chất chuyên dụng sau:

• Thiết bị cơ bản: Máy nhân gen PCR (hoặc Real-time PCR), máy ly tâm lạnh tốc độ cao, tủ an toàn sinh học cấp II, bể ổn nhiệt, máy lắc, tủ lạnh sâu (âm 20 độ C đến âm 80 độ C), hệ thống điện di gel agarose và máy đọc gel.
• Hóa chất và sinh phẩm: Kít tách chiết RNA, kít RT-PCR (hoặc Real-time RT-PCR) một bước hoặc hai bước, mồi đặc hiệu (primers) cho Betanodavirus, nước không có nuclease, agarose, dung dịch đệm điện di và chất nhuộm DNA.

4. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng (Chẩn đoán thực địa)

Chẩn đoán lâm sàng dựa trên việc quan sát các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và hành vi của cá trong môi trường nuôi:

• Triệu chứng lâm sàng: Cá bị bệnh thường có biểu hiện bơi lội bất thường như bơi quay tròn, bơi ngửa bụng, bơi không định hướng hoặc lao đầu xuống đáy. Cá kém ăn hoặc bỏ ăn hoàn toàn, màu sắc cơ thể chuyển sang tối sẫm (đặc biệt là phần lưng).
• Bệnh tích đại thể: Khi quan sát mắt cá có thể thấy hiện tượng đục thủy tinh thể hoặc lồi mắt. Bong bóng cá bị phình to bất thường, chứa đầy khí khiến cá không thể lặn xuống sâu.

5. Phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Đây là bước quyết định để xác định chính xác sự hiện diện của Betanodavirus gây bệnh VNN:

• Lấy mẫu và xử lý mẫu: Mẫu bệnh phẩm ưu tiên là não, mắt (võng mạc) của cá nghi nhiễm bệnh. Đối với cá bột hoặc cá hương kích thước nhỏ, có thể thu nguyên con. Mẫu phải được bảo quản lạnh và vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.
• Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen mục tiêu của Betanodavirus (thường là vùng gen mã hóa cho protein vỏ capsid trên đoạn RNA2). Kết quả được xác định thông qua điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, nếu xuất hiện vạch sáng có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết thì kết luận mẫu dương tính.
• Phương pháp Real-time RT-PCR: Là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, cho phép phát hiện và định lượng virus nhanh chóng thông qua việc theo dõi tín hiệu huỳnh quang phát ra trong quá trình nhân bản gen mà không cần qua bước điện di.
• Kiểm tra bệnh lý vi thể (Mô bệnh học): Cắt lát mỏng mô não và võng mạc mắt, nhuộm hematoxylin và eosin (H&E). Dưới kính hiển vi quang học, mô bệnh học của cá nhiễm VNN đặc trưng bởi sự xuất hiện của các không bào (vacuoles) lớn nhỏ khác nhau trong tế bào thần kinh của não và võng mạc, tạo nên cấu trúc dạng bọt biển.

6. Đánh giá và kết luận kết quả chẩn đoán

Một mẫu cá được kết luận là mắc bệnh hoại tử thần kinh (VNN) khi đáp ứng các tiêu chí sau:

• Có các triệu chứng lâm sàng điển hình như bơi quay tròn, bơi ngửa, biến đổi màu sắc cơ thể và phình bong bóng.
• Kết quả xét nghiệm bằng phương pháp RT-PCR hoặc Real-time RT-PCR cho kết quả dương tính với Betanodavirus.
• Hoặc kết quả kiểm tra mô bệnh học phát hiện các không bào đặc trưng trong mô não và võng mạc mắt của cá.