Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6187-2:2020 (hoàn toàn tương đương với ISO 9308-2:2012) về Chất lượng nước - Phương pháp định lượng vi khuẩn Escherichia coli và coliform - Phần 2: Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất được ban hành nhằm hướng dẫn phương pháp xác định và định lượng vi khuẩn coliform và Escherichia coli (E. coli) trong các nguồn nước bằng phương pháp sử dụng môi trường lỏng.

Phạm vi và đối tượng áp dụng của tiêu chuẩn

Tiêu chuẩn này áp dụng cho tất cả các loại nước, bao gồm nước mặt, nước ngầm, nước uống, nước thải và nước có chứa lượng lớn chất lơ lửng hoặc có mật độ vi khuẩn dị dưỡng cao. Tuy nhiên, đối với nước biển, phương pháp này cần được lưu ý đặc biệt hoặc pha loãng thích hợp để tránh ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của vi khuẩn.

Nguyên tắc của phương pháp đếm số có xác suất lớn nhất (MPN)

• Phương pháp dựa trên việc phát hiện các enzyme đặc trưng của nhóm vi khuẩn mục tiêu trong môi trường nuôi cấy lỏng đặc hiệu.
• Vi khuẩn coliform được xác định dựa trên khả năng sinh enzyme beta-D-galactosidase, giúp thủy phân cơ chất tạo màu vàng đặc trưng.
• Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) được xác định dựa trên khả năng sinh enzyme beta-D-glucuronidase, giúp thủy phân cơ chất tạo ra huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím (UV) ở bước sóng 365 nm.
• Số lượng vi khuẩn được ước lượng dựa trên số lượng giếng hoặc ống nghiệm có phản ứng dương tính, sau đó tra bảng MPN để xác định số lượng có xác suất lớn nhất trên 100 ml mẫu.

Thiết bị, dụng cụ và môi trường nuôi cấy

• Môi trường nuôi cấy chuyên dụng (như Colilert-18 hoặc tương đương) chứa các cơ chất chỉ thị màu và chỉ thị huỳnh quang.
• Tủ ấm có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định ở mức 36 độ C (sai số 2 độ C).
• Đèn cực tím (UV) phát ra ánh sáng ở bước sóng 365 nm để quan sát hiện tượng phát huỳnh quang của E. coli.
• Hệ thống khay định lượng (ví dụ khay Quanti-Tray) và máy hàn khay chuyên dụng để phân phối mẫu vào các giếng nhỏ.
• Dụng cụ thủy tinh hoặc nhựa vô trùng để lấy mẫu và pha loãng mẫu nước.

Quy trình tiến hành thử nghiệm

• Chuẩn bị mẫu: Mẫu nước được thu thập trong chai vô trùng. Nếu mẫu nước có chứa clo dư, cần bổ sung natri thiosulfat để trung hòa trước khi phân tích. Tiến hành pha loãng mẫu bằng nước pha loãng vô trùng nếu dự đoán mật độ vi khuẩn vượt quá giới hạn phát hiện của khay.
• Phối trộn môi trường: Thêm lượng môi trường nuôi cấy dạng bột khô vào 100 ml mẫu nước (hoặc mẫu đã pha loãng), lắc đều cho tan hoàn toàn.
• Phân phối vào khay: Rót toàn bộ hỗn hợp mẫu và môi trường vào khay định lượng chuyên dụng, sau đó đưa qua máy hàn khay để phân phối đều vào các giếng lớn và giếng nhỏ.
• Ủ mẫu: Đặt khay đã hàn vào tủ ấm ở nhiệt độ 36 độ C (sai số 2 độ C) trong khoảng thời gian từ 18 giờ đến 22 giờ.

Đọc kết quả và tính toán số lượng vi khuẩn

• Xác định coliform: Quan sát các giếng trên khay sau thời gian ủ. Những giếng chuyển sang màu vàng (đậm hơn hoặc bằng màu của giếng đối chứng âm) được tính là dương tính với coliform.
• Xác định E. coli: Đặt khay dưới ánh sáng đèn UV 365 nm trong phòng tối. Những giếng có màu vàng đồng thời phát huỳnh quang màu xanh lam được tính là dương tính với E. coli.
• Tính toán kết quả: Đếm số lượng giếng lớn và giếng nhỏ dương tính đối với từng chỉ tiêu. Tra bảng MPN đi kèm của nhà sản xuất khay để xác định trị số MPN trên 100 ml mẫu nước.

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6187-2:2020 thay thế cho các tiêu chuẩn cũ liên quan đến phương pháp đếm số có xác suất lớn nhất đối với coliform và E. coli trong nước. Tiêu chuẩn này có hiệu lực kể từ ngày công bố và được áp dụng rộng rãi tại các phòng thử nghiệm chất lượng nước trên toàn quốc.