Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-1:2019 về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 1: Yêu cầu chung được ban hành nhằm thiết lập các nguyên tắc, quy chuẩn kỹ thuật thống nhất trong việc phát hiện, phân lập và định danh các loài nấm gây hại trên thực vật và sản phẩm thực vật tại Việt Nam.

Phạm vi và đối tượng áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu chung về trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất, môi trường nuôi cấy, phương pháp thu thập, xử lý mẫu và các bước cơ bản trong quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật. Đối tượng áp dụng bao gồm các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm dịch thực vật, tổ chức nghiên cứu và cá nhân hoạt động trong lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật.

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường nuôi cấy

• Thiết bị chuyên dụng: Phòng thí nghiệm phải được trang bị đầy đủ các thiết bị cơ bản bao gồm kính hiển vi quang học có độ phóng đại lớn, kính hiển vi soi nổi, tủ cấy vô trùng (tủ an toàn sinh học), tủ ấm nuôi cấy nấm, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), cân phân tích và máy ly tâm.
• Dụng cụ thí nghiệm: Sử dụng các dụng cụ thủy tinh hoặc nhựa chuyên dụng như đĩa petri, ống nghiệm, lam kính, lamen, que cấy, kim mũi mác và các dụng cụ cắt tỉa mẫu đã được tiệt trùng.
• Hóa chất và môi trường: Chuẩn bị sẵn các hóa chất cơ bản để nhuộm màu và quan sát cấu trúc nấm (như lactophenol cotton blue, nước cất vô trùng). Các môi trường nuôi cấy thông dụng như môi trường thạch-khoai tây-đường (PDA), môi trường thạch-nước (WA) hoặc các môi trường chọn lọc khác phải được pha chế và tiệt trùng đúng quy chuẩn.

Quy trình thu thập, tiếp nhận và bảo quản mẫu bệnh

• Thu thập mẫu: Mẫu cây bị bệnh phải được thu thập ở các bộ phận có triệu chứng điển hình (lá, thân, rễ, hoa, quả hoặc hạt). Mẫu phải đại diện cho lô hàng hoặc khu vực điều tra và phải kèm theo đầy đủ thông tin về địa điểm, ngày thu mẫu, ký chủ và triệu chứng lâm sàng.
• Vận chuyển và tiếp nhận: Mẫu sau khi thu thập phải được chứa trong túi giấy hoặc hộp chuyên dụng, tránh làm dập nát hoặc ẩm mốc thứ cấp. Khi chuyển về phòng thí nghiệm, mẫu phải được đăng ký vào sổ theo dõi và cấp mã số định danh duy nhất.
• Bảo quản mẫu: Đối với các mẫu chưa thực hiện giám định ngay, cần bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ thích hợp (thường từ 4 độ C đến 10 độ C) để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật hoại sinh khác làm ảnh hưởng đến kết quả phân lập.

Phương pháp giám định nấm gây bệnh thực vật

• Quan sát triệu chứng và đặc điểm hình thái trực tiếp: Tiến hành kiểm tra triệu chứng bệnh trên mẫu vật bằng mắt thường và kính hiển vi soi nổi. Thực hiện làm tiêu bản tạm thời từ các cấu trúc của nấm (sợi nấm, bào tử, cơ quan sinh sản) xuất hiện trên vết bệnh để quan sát dưới kính hiển vi quang học.
• Phân lập và nuôi cấy nấm: Trường hợp không thể định danh trực tiếp, tiến hành khử trùng bề mặt mẫu bệnh bằng hóa chất thích hợp (như cồn hoặc nước Javel loãng), rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó cắt phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh để cấy lên môi trường dinh dưỡng. Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng thích hợp để nấm phát triển tản nấm thuần khiết.
• Xác định đặc điểm sinh học và vi học: Theo dõi tốc độ sinh trưởng, màu sắc, dạng tản nấm trên môi trường nuôi cấy. Đo đạc kích thước, hình dạng của bào tử, cuống đỡ bào tử và các cấu trúc đặc trưng khác để so sánh với các tài liệu phân loại học chuẩn.
• Phương pháp sinh học phân tử (khi cần thiết): Đối với các loài nấm khó định danh bằng hình thái hoặc các loài đối tượng kiểm dịch thực vật, áp dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các vùng gen đặc trưng (như vùng ITS) và tiến hành giải trình tự gen để đối chiếu trên cơ sở dữ liệu quốc tế.

Yêu cầu về hồ sơ giám định và lưu mẫu

• Lập báo cáo kết quả: Kết quả giám định phải được thể hiện bằng văn bản (Phiếu kết quả giám định) bao gồm các thông tin về tên khoa học của nấm (tên chi, tên loài, tác giả), phương pháp giám định đã áp dụng và kết luận về khả năng gây bệnh.
• Lưu trữ hồ sơ và mẫu chuẩn: Toàn bộ hồ sơ giám định, hình ảnh triệu chứng, hình ảnh vi học và tiêu bản khô hoặc mẫu nấm thuần khiết phải được lưu trữ theo quy định để phục vụ công tác hậu kiểm hoặc giải quyết tranh chấp khi có yêu cầu.

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-1:2019 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày được công bố bởi cơ quan nhà nước có thẩm quyền, thay thế hoặc bổ sung cho các hướng dẫn kỹ thuật trước đây về giám định nấm gây bệnh thực vật nhằm nâng cao năng lực kiểm dịch và bảo vệ thực vật quốc gia.