Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7715-2:2007 (hoàn toàn tương đương với ISO 10272-2:2006) quy định phương pháp định lượng các loài Campylobacter ưa nhiệt (Campylobacter spp.) có trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Dưới đây là tóm tắt chi tiết và chuyên sâu về phần mở đầu cùng các điều khoản đầu tiên (từ Điều 1 đến Điều 4) của tiêu chuẩn này.

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi khuẩn Campylobacter spp. dựa trên kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch chọn lọc. Phạm vi áp dụng cụ thể bao gồm:

• Các sản phẩm thực phẩm dành cho con người tiêu dùng.
• Các sản phẩm thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi.
• Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, chế biến và xử lý thực phẩm.
• Lưu ý đặc biệt: Do tính chất đa dạng của các sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, phương pháp này có thể không phù hợp hoàn toàn cho một số sản phẩm cụ thể. Trong trường hợp đó, có thể áp dụng các phương pháp thay thế đã được chứng minh tính hiệu quả.

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, việc viện dẫn các tài liệu tiêu chuẩn liên quan là bắt buộc. Các tài liệu viện dẫn cốt lõi bao gồm:

• TCVN 6404 (ISO 7218): Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật. Đây là tiêu chuẩn nền tảng quy định các yêu cầu kỹ thuật chung và hướng dẫn thực hành trong phòng thí nghiệm vi sinh.
• TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần): Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật. Tiêu chuẩn này hướng dẫn chi tiết cách xử lý từng loại nền mẫu cụ thể trước khi tiến hành nuôi cấy.

Tiêu chuẩn đưa ra các định nghĩa kỹ thuật chính xác nhằm thống nhất cách hiểu và thực hiện quy trình phân tích:

• Campylobacter spp.: Là các vi khuẩn hình cong, hình chữ S hoặc hình xoắn, có khả năng di động nhanh, xoay tròn bằng một hoặc hai roi ở đầu. Chúng có phản ứng oxidase dương tính và phát triển trong điều kiện khí trường vi hiếu khí (microaerophilic) ở nhiệt độ thích hợp (thường là 41,5 độ C đối với các loài ưa nhiệt như Campylobacter jejuni, Campylobacter coli và Campylobacter lari).
• Định lượng Campylobacter spp.: Là việc xác định số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của Campylobacter spp. trên một gam (g) hoặc một mililít (ml) mẫu thử, khi tiến hành thử nghiệm theo các bước được quy định trong tiêu chuẩn này.

Phương pháp định lượng Campylobacter spp. bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc được thực hiện dựa trên nguyên tắc nuôi cấy chọn lọc và khẳng định sinh hóa qua các bước nghiêm ngặt sau:

• Chuẩn bị mẫu và pha loãng: Tiến hành chuẩn bị huyền phù ban đầu từ mẫu thử theo tỷ lệ quy định, sau đó thực hiện các bước pha loãng thập phân tiếp theo bằng dung dịch pha loãng thích hợp để đảm bảo mật độ vi khuẩn phù hợp cho việc đếm khuẩn lạc.
• Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc: Sử dụng một lượng thể tích xác định của dịch mẫu hoặc dịch pha loãng để cấy trải lên bề mặt của môi trường thạch chọn lọc rắn. Môi trường thường được sử dụng phổ biến là thạch mCCD (Modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar) hoặc các môi trường thạch chọn lọc tương đương khác đã được phê duyệt.
• Ủ ấm trong điều kiện vi hiếu khí: Các đĩa thạch sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 41,5 độ C trong khoảng thời gian từ 40 giờ đến 48 giờ. Quá trình ủ bắt buộc phải diễn ra trong môi trường khí trường vi hiếu khí đặc biệt (thông thường chứa khoảng 5% Oxy, 10% Cacbon dioxit và 85% Nitơ) để tạo điều kiện tối ưu cho sự phát triển của Campylobacter spp. và ức chế các vi sinh vật hiếu khí khác.
• Đếm và chọn lọc khuẩn lạc nghi ngờ: Sau thời gian ủ, tiến hành đếm tất cả các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái đặc trưng của Campylobacter spp. trên các đĩa thạch chọn lọc. Khuẩn lạc điển hình thường có màu xám, hơi ướt, dẹt và có xu hướng lan rộng trên bề mặt thạch.
• Khẳng định sinh hóa: Chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc nghi ngờ từ mỗi đĩa để tiến hành các thử nghiệm khẳng định. Các thử nghiệm này bao gồm: kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi (nhuộm Gram hoặc quan sát độ di động đặc trưng), thử nghiệm hoạt tính oxidase, thử nghiệm catalase, và khả năng phát triển ở các điều kiện nhiệt độ hoặc khí trường khác nhau để xác định chính xác sự hiện diện của Campylobacter spp.
• Tính toán kết quả: Dựa trên số lượng khuẩn lạc đã được khẳng định và hệ số pha loãng của mẫu, tiến hành tính toán để đưa ra mật độ Campylobacter spp. có trong một gam hoặc một mililít mẫu ban đầu theo hướng dẫn của TCVN 6404 (ISO 7218).