Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4328:2001 (hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 5983:1997) quy định phương pháp Kjeldahl để xác định hàm lượng nitơ và tính hàm lượng protein thô trong thức ăn chăn nuôi. Dưới đây là phần tóm tắt chi tiết, chuyên sâu về phần mở đầu cùng các điều khoản cốt lõi đầu tiên từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

- Điều 1: Phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn

Điều khoản này xác định rõ giới hạn, đối tượng và phạm vi hiệu lực của phương pháp thử nghiệm:

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng nitơ trong thức ăn chăn nuôi theo kỹ thuật Kjeldahl, từ đó làm cơ sở để tính toán hàm lượng protein thô của sản phẩm.
• Phương pháp này áp dụng rộng rãi cho hầu hết các loại thức ăn chăn nuôi, thức ăn đơn, thức ăn hỗn hợp và các loại nguyên liệu thô dùng trong chế biến thức ăn chăn nuôi.
• Tiêu chuẩn cũng đưa ra lưu ý quan trọng về giới hạn: Phương pháp Kjeldahl thông thường này không áp dụng để xác định các dạng nitơ phi protein khác như nitơ dạng nitrat, nitrit, amoniac tự do, ure hoặc các hợp chất nitơ vòng khác (như pyridin, quinolin) do các hợp chất này không bị chuyển hóa hoàn toàn thành amoni sunfat trong quá trình vô cơ hóa thông thường nếu không có các bước xử lý hóa học đặc biệt bổ sung.

- Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác và đồng bộ, phòng thử nghiệm cần phải tham chiếu và phối hợp sử dụng với các tiêu chuẩn chất lượng và kỹ thuật liên quan sau:

• TCVN 4325:2001 (ISO 6497) về Thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu, nhằm đảm bảo mẫu thử nghiệm đưa vào phân tích có tính đại diện cao nhất cho toàn bộ lô hàng.
• TCVN 4851:1989 (ISO 3696) về Nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử, yêu cầu nước sử dụng trong suốt quá trình phân tích phải đạt tiêu chuẩn chất lượng tối thiểu là cấp 3 để tránh các sai số do tạp chất lẫn trong nước gây ra.

- Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp Kjeldahl

Nguyên lý hóa học cốt lõi của phương pháp xác định hàm lượng nitơ và protein thô được thực hiện nghiêm ngặt qua ba giai đoạn liên tiếp:

• Giai đoạn vô cơ hóa (Phân hủy mẫu): Mẫu thử được đun nóng và phân hủy hoàn toàn bằng axit sunfuric đậm đặc (H2SO4) dưới sự hỗ trợ của chất xúc tác hỗn hợp (thường là đồng sunfat và kali sunfat) để nâng cao nhiệt độ sôi của hỗn hợp axit. Quá trình này oxy hóa các hợp chất hữu cơ và chuyển hóa toàn bộ nitơ hữu cơ có trong mẫu thành amoni sunfat ((NH4)2SO4).
• Giai đoạn chưng cất giải phóng amoniac: Dịch vô cơ hóa sau khi để nguội được kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH) dư để giải phóng khí amoniac (NH3) tự do. Khí amoniac sinh ra được chưng cất lôi cuốn theo hơi nước và được hấp thụ hoàn toàn vào một lượng dư dung dịch axit boric (H3BO3) định sẵn.
• Giai đoạn chuẩn độ và tính toán: Lượng amoniac được hấp thụ trong dung dịch axit boric tạo thành phức hợp amoni borat sẽ được chuẩn độ trực tiếp bằng dung dịch axit chuẩn (axit clohydric HCl hoặc axit sunfuric H2SO4) với sự có mặt của chất chỉ thị màu hỗn hợp. Từ thể tích axit chuẩn tiêu tốn, kỹ thuật viên tính ra hàm lượng nitơ tổng số và nhân với hệ số chuyển đổi quy ước (thường là 6,25 đối với thức ăn chăn nuôi thông thường) để thu được hàm lượng protein thô.

- Điều 4: Thuốc thử và hóa chất yêu cầu

Tiêu chuẩn quy định rất nghiêm ngặt về chất lượng thuốc thử để đảm bảo độ lặp lại và độ tái lập của phép đo. Tất cả các hóa chất sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích (TKPT) và nước sử dụng phải là nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương:

• Axit sunfuric đậm đặc: Có khối lượng riêng d = 1,84 g/ml, yêu cầu không chứa nitơ để tránh làm sai lệch kết quả của mẫu trắng.
• Chất xúc tác hỗn hợp: Gồm kali sunfat (K2SO4) khan để tăng nhiệt độ sôi của axit và đồng (II) sunfat pentahydrat (CuSO4.5H2O) đóng vai trò là chất xúc tác chính đẩy nhanh quá trình oxy hóa. Tỷ lệ phối trộn thông thường là 10g K2SO4 và 1g CuSO4.5H2O cho mỗi mẫu phân tích.
• Dung dịch natri hydroxit (NaOH): Nồng độ khoảng 33% đến 40% (khối lượng/thể tích), dùng để kiềm hóa dịch phân hủy trong bước chưng cất.
• Dung dịch hấp thụ axit boric (H3BO3): Nồng độ từ 1% đến 4% (khối lượng/thể tích), dùng để hấp thụ khí amoniac bay ra.
• Dung dịch chuẩn axit clohydric (HCl) hoặc axit sunfuric (H2SO4): Nồng độ chính xác 0,1 N hoặc 0,25 N, được hiệu chuẩn kỹ càng để dùng làm dung dịch chuẩn độ trực tiếp.
• Chất chỉ thị màu hỗn hợp: Thường phối trộn giữa đỏ metyl (methyl red) và xanh metylen (methylene blue) hòa tan trong cồn, giúp nhận biết điểm tương đương nhạy bén thông qua sự chuyển màu rõ rệt từ xanh lá cây sang xám hồng hoặc tím hồng.
• Saccarozơ (C12H22O11): Chất hữu cơ tinh khiết không chứa nitơ, được sử dụng làm mẫu trắng để kiểm tra độ sạch của hóa chất và hiệu chỉnh sai số hệ thống của thiết bị.