Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5522:1991 (hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn ST SEV 5805:1986) quy định phương pháp xác định số lượng vi khuẩn thuộc chủng Lactobacillus trong các sản phẩm thực phẩm. Đây là văn bản kỹ thuật quan trọng làm cơ sở pháp lý và kỹ thuật cho các phòng thí nghiệm, cơ quan kiểm nghiệm và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm nhằm đánh giá chất lượng vi sinh vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa lên men và thực phẩm ứng dụng công nghệ sinh học.

Tiêu chuẩn định hướng chi tiết về đối tượng áp dụng cũng như nền tảng khoa học để nhận biết và định lượng chủng vi khuẩn này:

• Phạm vi áp dụng: Áp dụng đối với các sản phẩm thực phẩm có chứa hoặc yêu cầu kiểm soát mật độ vi khuẩn Lactobacillus trong quá trình chế biến, bảo quản và lưu thông trên thị trường.
• Nguyên tắc phương pháp: Phương pháp dựa trên việc gieo cấy một thể tích mẫu thử nhất định (hoặc các dung dịch pha loãng thập phân tương ứng) vào môi trường dinh dưỡng đặc hiệu. Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ và khí quyển tối ưu để kích thích sự phát triển của Lactobacillus, từ đó tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng xuất hiện trên đĩa nuôi cấy.

Để đảm bảo tính chính xác và độ lặp lại của kết quả thử nghiệm, tiêu chuẩn quy định nghiêm ngặt về trang thiết bị và hóa chất sử dụng:

• Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Yêu cầu sử dụng tủ ấm có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định ở mức quy định (thường từ 30 độ C đến 37 độ C), nồi hấp áp lực để tiệt trùng môi trường, kính hiển vi quang học, đĩa Petri vô trùng, pipet chia độ và các thiết bị đồng hóa mẫu chuyên dụng.
• Môi trường dinh dưỡng và thuốc thử: Sử dụng môi trường chọn lọc chuyên biệt cho vi khuẩn acid lactic (như môi trường MRS agar hoặc các môi trường tương đương có bổ sung chất ức chế vi sinh vật cạnh tranh). Các hóa chất dùng để pha chế dung dịch đệm pha loãng phải đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích vi sinh.

Quy trình phân tích được thực hiện tuần tự theo các bước kỹ thuật chuẩn hóa nhằm hạn chế tối đa sai số:

• Chuẩn bị mẫu và pha loãng: Tiến hành cân và đồng hóa mẫu thực phẩm ban đầu trong dung dịch pha loãng vô trùng theo tỷ lệ quy định. Tiếp tục thực hiện pha loãng theo dãy thập phân (10 mũ -1, 10 mũ -2, 10 mũ -3...) để thu được nồng độ vi khuẩn thích hợp cho việc đếm khuẩn lạc sau này.
• Cấy mẫu và nuôi cấy: Chuyển một lượng dịch mẫu đã pha loãng vào các đĩa Petri, sau đó đổ môi trường dinh dưỡng đã được làm nguội đến nhiệt độ thích hợp. Tiến hành nuôi cấy các đĩa trong tủ ấm ở điều kiện khí quyển thích hợp (ưu tiên điều kiện kị khí hoặc vi hiếu khí để tối ưu hóa sự phát triển của Lactobacillus) trong khoảng thời gian từ 48 đến 72 giờ.
• Đếm khuẩn lạc và thử nghiệm khẳng định: Chọn các đĩa có mật độ khuẩn lạc phù hợp (thường từ 15 đến 300 khuẩn lạc) để tiến hành đếm. Trong trường hợp cần thiết, thực hiện các thử nghiệm khẳng định bổ sung như nhuộm Gram (Lactobacillus là trực khuẩn Gram dương) và thử nghiệm enzyme catalase (Lactobacillus cho kết quả catalase âm tính).

Việc xử lý số liệu sau thử nghiệm được thực hiện theo công thức toán học thống nhất:

• Công thức tính toán: Số lượng vi khuẩn Lactobacillus trong một đơn vị khối lượng (gam) hoặc thể tích (mililít) mẫu thực phẩm được tính toán dựa trên tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn và hệ số pha loãng tương ứng.
• Biểu thị kết quả: Kết quả cuối cùng được ghi nhận dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mỗi gam (CFU/g) hoặc trên mỗi mililít (CFU/ml) mẫu thử. Báo cáo kết quả phải ghi nhận đầy đủ các thông tin về điều kiện nuôi cấy, phương pháp áp dụng và các sai lệch (nếu có) trong quá trình phân tích.