Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13517:2022 về Thức ăn chăn nuôi - Phân lập và định lượng Enterococcus (E. faecium) spp. được ban hành năm 2022 nhằm thiết lập quy trình kỹ thuật chuẩn hóa trong việc kiểm tra, giám sát chất lượng vi sinh vật đối với các sản phẩm thức ăn chăn nuôi. Tiêu chuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát an toàn sinh học, đánh giá chất lượng các chế phẩm vi sinh (probiotics) chứa Enterococcus faecium được sử dụng trong ngành chăn nuôi tại Việt Nam.

Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phân lập và định lượng các loài thuộc chi Enterococcus, đặc biệt tập trung vào chủng Enterococcus faecium (E. faecium), trong các loại thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi và các chế phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi.
• Đối tượng áp dụng bao gồm các phòng thử nghiệm đánh giá sự phù hợp, các cơ quan quản lý nhà nước về chất lượng thức ăn chăn nuôi, cùng các tổ chức, cá nhân sản xuất, kinh doanh, nhập khẩu thức ăn chăn nuôi trên lãnh thổ Việt Nam.

Nguyên tắc của phương pháp phân lập và định lượng

• Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thức ăn chăn nuôi được đồng nhất và pha loãng theo các tỷ lệ thập phân thích hợp bằng dung dịch đệm pha loãng chuyên dụng để đảm bảo giải phóng tối đa tế bào vi khuẩn mà không làm tổn thương chúng.
• Nuôi cấy và phân lập: Sử dụng các môi trường chọn lọc đặc trưng cho Enterococcus (như môi trường thạch Bile Esculin Azide hoặc các môi trường tương đương) để hạn chế sự phát triển của các nhóm vi sinh vật không mong muốn khác.
• Ủ ấm: Các đĩa petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ và thời gian quy định (thường từ 35 độ C đến 37 độ C trong vòng 24 giờ đến 48 giờ) để tạo điều kiện tối ưu cho sự phát triển của khuẩn lạc Enterococcus.
• Định lượng và khẳng định: Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng xuất hiện trên đĩa thạch. Các khuẩn lạc nghi ngờ sẽ được chọn lọc để thực hiện các thử nghiệm khẳng định sinh hóa (như nhuộm Gram, thử nghiệm catalase, khả năng phát triển ở các điều kiện nhiệt độ và nồng độ muối khác nhau) nhằm xác định chính xác sự hiện diện của Enterococcus faecium.

Yêu cầu về thiết bị, dụng cụ và môi trường nuôi cấy

• Thiết bị bắt buộc: Hệ thống tủ ấm duy trì nhiệt độ ổn định, máy dập mẫu (stomacher) hoặc máy lắc đồng nhất mẫu, cân phân tích có độ chính xác cao, kính hiển vi quang học và các dụng cụ thủy tinh vô trùng.
• Môi trường và hóa chất: Phải sử dụng các loại môi trường nuôi cấy đạt tiêu chuẩn chất lượng, nước cất hoặc nước khử khoáng có độ tinh khiết phù hợp để pha chế hóa chất, đảm bảo tính chính xác và độ lặp lại của kết quả thử nghiệm.

Quy trình thực hiện chi tiết

• Bước 1: Chuẩn bị phần mẫu thử và huyền phù ban đầu. Cân một lượng mẫu xác định (thường là 25g) cho vào túi vô trùng, thêm dung dịch pha loãng (thường là 225ml) và tiến hành đồng nhất mẫu bằng thiết bị chuyên dụng.
• Bước 2: Pha loãng thập phân. Chuyển một thể tích chính xác của huyền phù ban đầu sang các ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng để tạo ra các độ loãng tiếp theo (10^-2, 10^-3, v.v.) tùy thuộc vào mật độ vi sinh vật dự kiến trong mẫu.
• Bước 3: Cấy và ủ. Sử dụng phương pháp cấy trải hoặc cấy chìm trên môi trường thạch chọn lọc. Sau đó, lật ngược đĩa thạch và đưa vào tủ ấm để nuôi cấy trong khoảng thời gian quy định.
• Bước 4: Đọc kết quả và tính toán. Chọn các đĩa có số lượng khuẩn lạc nằm trong phạm vi tối ưu (thường từ 15 đến 300 khuẩn lạc) để đếm. Kết quả được tính toán và biểu thị dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên một gam hoặc một mililit mẫu thử.

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13517:2022 có hiệu lực kể từ ngày ban hành. Việc áp dụng tiêu chuẩn này giúp thống nhất phương pháp thử nghiệm trên toàn quốc, tạo cơ sở pháp lý và kỹ thuật vững chắc cho việc kiểm soát chất lượng thức ăn chăn nuôi, bảo vệ sức khỏe vật nuôi và an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.