Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10697:2015 (hoàn toàn tương đương với EN 12146:1996) quy định phương pháp enzym sử dụng phổ NADP để xác định hàm lượng sucrose trong nước rau, quả và các sản phẩm liên quan. Dưới đây là tóm tắt chi tiết và chuyên sâu về phạm vi áp dụng, tài liệu viện dẫn, nguyên tắc và các yêu cầu kỹ thuật ban đầu từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

- Phạm vi áp dụng (Điều 1)

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng sucrose có trong nước rau, quả và các sản phẩm tương tự.
• Phương pháp này cho phép định lượng chính xác sucrose bằng cách sử dụng phản ứng enzym đặc hiệu, giúp kiểm soát chất lượng và phát hiện gian lận thương mại (như việc bổ sung đường ngoài ý muốn) trong các sản phẩm nước trái cây và nước rau quả thương mại.

- Tài liệu viện dẫn (Điều 2)

• Các tài liệu viện dẫn sau đây là bắt buộc để áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
• TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. Đây là tiêu chuẩn cốt lõi đảm bảo chất lượng nước sử dụng trong quá trình pha chế thuốc thử và tiến hành phản ứng enzym không bị lẫn tạp chất gây sai lệch kết quả đo phổ.

- Nguyên tắc của phương pháp (Điều 3)

Nguyên tắc xác định hàm lượng sucrose dựa trên chuỗi phản ứng enzym đặc hiệu và phép đo quang phổ hấp thụ của NADPH được tạo thành. Quá trình này diễn ra qua các bước cụ thể sau:

• Bước 1: Thủy phân sucrose: Sucrose có trong mẫu thử được thủy phân bằng enzym beta-fructosidase (invertase) ở pH 4,6 để tạo thành D-glucose và D-fructose tự do.
• Bước 2: Phosphoryl hóa D-glucose: D-glucose (bao gồm cả lượng D-glucose tự do ban đầu và lượng tạo ra từ quá trình thủy phân sucrose) được phosphoryl hóa bởi adenosin triphosphat (ATP) dưới sự xúc tác của enzym hexokinase (HK) để tạo thành glucose-6-phosphat (G-6-P) và adenosin diphosphat (ADP).
• Bước 3: Oxy hóa G-6-P: Glucose-6-phosphat (G-6-P) tiếp tục bị oxy hóa bởi nicotinamid adenin dinucleotid phosphat dạng oxy hóa (NADP) dưới sự xúc tác của enzym glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6P-DH) để tạo thành D-gluconat-6-phosphat và nicotinamid adenin dinucleotid phosphat dạng khử (NADPH).
• Bước 4: Đo phổ hấp thụ: Lượng NADPH được tạo thành trong phản ứng tỷ lệ thuận với lượng D-glucose có trong dung dịch. Hàm lượng NADPH được xác định bằng cách đo độ hấp thụ cực đại của nó ở bước sóng 340 nm (hoặc các vạch phổ của đèn thủy ngân ở bước sóng 334 nm hoặc 365 nm).
• Tính toán hàm lượng sucrose: Hàm lượng sucrose được tính toán dựa trên sự chênh lệch giữa tổng lượng D-glucose đo được sau khi thủy phân bằng enzym beta-fructosidase và lượng D-glucose tự do có sẵn trong mẫu ban đầu (được xác định bằng một phép thử song song không qua bước thủy phân).

- Thuốc thử và các chất chuẩn (Điều 4)

Để đảm bảo tính chính xác và độ lặp lại của phép đo, các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng phải đạt tiêu chuẩn loại 3 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các hóa chất và chế phẩm enzym chính bao gồm:

• Dung dịch đệm citrat (pH 4,6): Được sử dụng để tạo môi trường tối ưu cho phản ứng thủy phân sucrose của enzym beta-fructosidase.
• Dung dịch đệm triethanolamin (pH 7,6): Tạo môi trường pH thích hợp cho các phản ứng phosphoryl hóa và oxy hóa tiếp theo của các enzym HK và G6P-DH.
• Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat (NADP): Muối dinatri của NADP, hoạt động như một chất nhận hydro trong phản ứng oxy hóa G-6-P.
• Adenosin triphosphat (ATP): Muối dinatri của ATP, cung cấp gốc phosphat cho phản ứng phosphoryl hóa glucose.
• Enzym Beta-fructosidase (Invertase): Chế phẩm enzym dạng bột hoặc dung dịch, có hoạt độ xúc tác đặc hiệu cao để thủy phân hoàn toàn sucrose mà không ảnh hưởng đến các liên kết glycosid khác.
• Hỗn hợp enzym Hexokinase (HK) và Glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6P-DH): Các enzym này phải đảm bảo độ tinh khiết cao, không bị lẫn các enzym tạp chất khác có thể phân hủy glucose hoặc NADP/NADPH tự do.
• Dung dịch sucrose chuẩn: Được sử dụng để kiểm tra hiệu năng của hệ thống enzym và thiết lập đường chuẩn hoặc kiểm soát độ nhạy của thiết bị đo phổ.