TIÊU CHUẨN NGÀNH

28 TCN 200 : 2004

VIBRIO CHOLERAE TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH

Vibrio cholerae in fishery products - Method for qualitative analysis

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính vi khuẩn Vibrio cholerae trong sản phẩm thuỷ sản.

2. Phương pháp tham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo chương 9, Sổ tay phân tích vi sinh, tái bản lần 8 năm 1998 của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ.

3. Nguyên tắc

Vibrio cholerae thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae là phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng di động, phản ứng oxidaza dương tính, phát triển được ở nhiệt độ 42⁰C, lên men đường sacaroza, khử lysin; phát triển được ở môi trường không có muối nhưng không phát triển được ở môi trường có nồng độ muối lớn hơn hoặc bằng 6 %; nhạy với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat.

Phát hiện Vibrio cholerae bằng cách tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc và cấy chuyển phân lập trên môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh.

4. Thiết bị, dụng cụ và môi trường, thuốc thử

4.1 Thiết bị, dụng cụ

4.1.1 Tủ ấm (37,0⁰C± 1,0⁰C).

4.1.2 Bể điều nhiệt (42,0⁰C± 0,2⁰C).

4.1.3 Cân có độ chính xác 0,0001 g.

4.1.4 Máy nghiền đồng thể.

4.1.5 Máy lắc ống nghiệm.

4.1.6 Đĩa petri.

4.1.7 Ống nghiệm đường kính các cỡ: 13, 16 và 18 mm.

4.1.8 Một số thiết bị thông thường khác như: máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp thanh trùng, tủ lạnh.

4.2 Môi trường, thuốc thử

4.2.1 Nước pepton kiềm: Ancalin Peptone Water (APW)

 Pepton : 10,00 g

 Natri clorua (NaCl) : 10,00 g

 Nước cất : 1,00 lít pH = 8,5 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình chứa thích hợp. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi.

4.2.2 Môi trường phân lập: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối-Sacaroza (TCBS thạch)

Pepton : 10,00 g

 Cao nấm men : 5,00 g

 Natri xitrat : 10,00 g

 Natri thiosunphat(Na₂S₂O₃) : 10,00 g

 Mật bò : 5,00 g

 Sacaroza : 20,00 g

 Natri clorua (NaCl) : 10,00 g

 Sắt (III) xitrat (FeC₆H₅O₇) : 1,00 g

 Natri cholate : 3,00 g

 Xanh bromthymol : 0,04 g

 Xanh thymol : 0,04 g

 Thạch  : 15,00 g.

Nước cất vô trùng : 1,00 lít pH = 8,6 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C).

Đun sôi để hoà tan hoàn toàn các thành phần rồi làm nguội ngay tới nhiệt độ khoảng 50⁰C. Rót 15 - 20 ml vào các đĩa petri vô trùng. Trước khi sử dụng phải làm khô đĩa môi trường bằng cách để qua đêm ở nhiệt độ trong phòng hoặc đặt đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 37⁰C - 45⁰C.

Chú thích: không hấp khử trùng môi trường

4.2.3 Môi trường, thuốc thử sinh hoá

4.2.3.1 Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar -TSI

Pepton : 15,00 g

Proteose pepton : 5,00 g

Cao thịt bò : 3,00 g

Cao nấm men : 3,00 g

Natri clorua (NaCl) : 5,00 g

Lactoza : 10,00 g

Sacaroza : 10,00 g

Glucoza : 1,00 g

Sắt (II) sunphat (FeSO₄) : 0,20 g

Natri thiosunphat(Na₂S₂O₃) : 0,30 g

Đỏ phenol : 0,024 g

Thạch  : 12,00 g

Nước cất : 1,00 lít pH = 7,4 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Hoà tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút. Trước khi môi trường đông, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm.

4.2.3.2 Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar -KIA

Polypepton pepton : 20,00 g

Natri clorua (NaCl) : 5,00 g

Lactoza : 20,00 g

Dextroza : 1,00 g

Sắt ammoni xitrat: 0,50 g

Natri thiosulphat (Na₂S₂O₃) : 0,50 g

Phenon đỏ : 0,025 g

Thạch : 15,00 g

Nước cất : 1,00 lit pH = 7,4 ± 0.2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Cách pha như quy định tại Điều 4.2.3.1

4.2.3.3 Hugh - Leifson Glucoza

Pepton : 2,00 g

Cao nấm men : 0,50 g

Natri clorua (NaCl) : 30,00 g

Dextroza : 10,00 g

Tím bromcresol : 0,015 g

Thạch : 3,00 g

Nước cất : 1 ,00 lít pH = 7,4 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Đun