TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5283 : 2007

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRYPTOPHAN

Animal feeding stuffs – Determination of tryptophan content

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp xác định hàm lượng tryptophan tự do và tổng số trong thức ăn chăn nuôi (ví dụ: thức ăn hoàn chỉnh và thức ăn bổ sung, nguyên liệu thô, nguyên liệu trong hỗn hợp, sản phẩm premix, thức ăn đậm đặc…). Không phân biệt giữa dạng D- và L-.

2. Nguyên tắc

Để xác định tryptophan tổng số, thủy phân mẫu trong môi trường kiềm bằng dung dịch bari hydroxit bão hòa và đun nóng đến 110 ^oC trong 20 giờ. Sau khi thủy phân, bổ sung chất nội chuẩn.

Để xác định tryptophan tự do, chiết mẫu trong môi trường axit nhẹ với sự có mặt của chất nội chuẩn.

Tryptophan và chất nội chuẩn trong dịch thủy phân hoặc dịch chiết được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo cột C₁₈ có phát hiện huỳnh quang.

3. Thuốc thử và vật liệu

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có các quy định khác.

3.1. Nước cất hai lần, hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (độ dẫn điện < 10 µS/cm).

3.2. Chất chuẩn: trytophan (tinh khiết/hàm lượng ≥ 99 %) được làm khô trong điều kiện chân không qua phospho pentoxit.

3.3. Chất nội chuẩn: a-metyltryptophan (tinh khiết/hàm lượng ≥ 99 %) được làm khô trong điều kiện chân không qua phospho pentoxit.

3.4. Bari hydroxit octahydrat

Cẩn thận không để Ba(OH)₂.8H₂O tiếp xúc lâu trong không khí để tránh hình thành BaCO₃, mà có thể gây cản trở phép xác định (xem B.3).

3.5. Natri hydroxit

3.6. Axit orthophosphoric, w = 85 %.

3.7. Axit clohydric đậm đặc, r₂₀ = 1,19 g/ml.

3.8. Metanol, loại dùng cho HPLC.

3.9. Xăng nhẹ, có khoảng sôi từ 40 ^oC đến 60 ^oC.

3.10. Dung dịch natri hydroxit, c = 1 mol/l.

Hòa tan 40,0 g NaOH (3.5) trong nước (3.1) và thêm nước (3.1) cho đến 1 lít.

3.11. Axit clohydric, c = 6 mol/l.

Lấy 492 ml HCl (3.7) và thêm nước (3.1) cho đến 1 lít.

3.12. Axit clohydric, c = 1 mol/l.

Lấy 82 ml HCl (3.7) và thêm nước (3.1) cho đến 1 lít.

3.13. Axit clohydric, c = 0,1 mol/l.

Lấy 8,2 ml HCl (3.7) và thêm nước (3.1) cho đến 1 lít.

3.14. Axit orthophosphoric, c = 0,5 mol/l.

Lấy 34 ml axit orthophosphoric (3.7) và thêm nước (3.1) cho đến 1 lít.

3.15. Dung dịch tryptophan đậm đặc (3.2), c = 0,000 5000 g/ml.

Hòa tan 0,25 g tryptophan (3.2) (đã cân chính xác đến 0,1 mg) trong axit clohydric (3.13) vào bình định mức 500 ml và thêm axit clohydric (3.13) cho đến vạch. Bảo quản dung dịch này ở nhiệt độ -18 ^oC tối đa là bốn tuần.

3.16. Dung dịch nội chuẩn đậm đặc, c = 0,000 54 g/ml.

Hòa tan 0,27 (3.3) (đã cân chính xác đến 0,1 mg) trong axit clohydric (3.13) vào bình định mức 500 ml và thêm axit clohydric (3.13) cho đến vạch. Bảo quản ở nhiệt độ -18^oC tối đa là bốn tuần.

3.17. Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn của tryptophan và chất nội chuẩn

Lấy 2,00 ml dung dịch tryptophan đậm đặc (3.15) và 2,00 ml dung dịch nội chuẩn đậm đặc () (3.16). Pha loãng bằng nước (3.1) và metanol (3.8) đến cùng một thể tích và cùng một nồng độ của meta