Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10780-2:2015 (hoàn toàn tương đương với ISO/TS 6579-2:2012) quy định phương pháp định lượng vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường bằng kỹ thuật số đếm có xác suất lớn nhất được thu nhỏ (miniaturized MPN). Dưới đây là tóm tắt chi tiết nội dung phần mở đầu và các điều khoản đầu tiên từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

- Điều 1: Phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi khuẩn Salmonella spp. có mặt trong các sản phẩm thực phẩm dành cho con người và thức ăn dành cho động vật.
• Phương pháp này cũng được áp dụng cho các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, chế biến, xử lý thực phẩm, cũng như các mẫu phân động vật hoặc mẫu môi trường ở giai đoạn sản xuất ban đầu (như bụi, mẫu quét bề mặt chuồng trại).
• Kỹ thuật số đếm có xác suất lớn nhất được thu nhỏ (miniaturized MPN) đặc biệt phù hợp cho các mẫu có mật độ Salmonella dự kiến thấp hoặc trung bình, giúp tối ưu hóa lượng hóa chất, môi trường và không gian nuôi cấy so với phương pháp MPN truyền thống.
• Tiêu chuẩn này không khuyến cáo áp dụng trực tiếp cho việc định lượng Salmonella trong các mẫu có mức độ ô nhiễm vi sinh vật nền quá cao, vì sự phát triển mạnh của các vi sinh vật khác có thể gây cản trở sự phát triển của Salmonella trên môi trường chọn lọc.

- Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, cần tham chiếu đến các tài liệu tiêu chuẩn sau đây (đối với các tài liệu ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu, đối với tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất):

• TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.
• TCVN 7391 (tất cả các phần) (ISO 6887), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.
• TCVN 10780-1 (ISO 6579), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện, định lượng và xác định kiểu huyết thanh của Salmonella - Phần 1: Phương pháp phát hiện Salmonella.

- Điều 3: Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn đưa ra các định nghĩa cốt lõi để thống nhất cách hiểu và thực hiện quy trình thử nghiệm:

• Salmonella spp.: Là các vi khuẩn hình thành các khóm đặc trưng hoặc không đặc trưng trên các môi trường đặc chọn lọc và có các phản ứng sinh hóa, huyết thanh học khẳng định theo mô tả trong tiêu chuẩn này và TCVN 10780-1.
• Kỹ thuật số đếm có xác suất lớn nhất được thu nhỏ (Miniaturized MPN technique): Là phương pháp ước lượng mật độ vi khuẩn dựa trên việc phân phối các thể tích mẫu thử (hoặc dung dịch pha loãng) vào các giếng của khay vi thể (microtiter plate) chứa môi trường lỏng hoặc bán rắn chọn lọc, sau đó ủ và xác định tỷ lệ các giếng dương tính để tra bảng MPN.

- Điều 4: Nguyên tắc của phương pháp định lượng Salmonella thu nhỏ

Phương pháp định lượng bằng kỹ thuật MPN thu nhỏ dựa trên quy trình gồm bốn giai đoạn liên tiếp được thiết kế tối ưu hóa trên khay vi thể:

• Giai đoạn 1: Tăng sinh không chọn lọc (Pre-enrichment) - Mẫu thử được hòa loãng và đồng nhất trong môi trường nước pepton đệm (BPW) ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ thích hợp, sau đó được ủ ở 37 độ C trong khoảng thời gian quy định để phục hồi các tế bào Salmonella bị tổn thương.
• Giai đoạn 2: Tăng sinh chọn lọc thu nhỏ (Miniaturized selective enrichment) - Sử dụng khay vi thể (thường là khay 12 giếng hoặc 96 giếng). Các thể tích dịch tăng sinh từ giai đoạn 1 được chuyển vào các giếng chứa môi trường bán rắn chọn lọc Rappaport-Vassiliadis sửa đổi (MSRV). Môi trường MSRV bán rắn cho phép các chủng Salmonella có khả năng di động di chuyển tạo ra vùng đục xung quanh điểm cấy, đồng thời ức chế các vi sinh vật không phải Salmonella. Quá trình ủ được thực hiện ở 41,5 độ C.
• Giai đoạn 3: Phân lập trên các môi trường đặc chọn lọc (Isolation on selective solid media) - Từ các giếng MSRV có biểu hiện dương tính (vùng di động đục rõ rệt), tiến hành cấy chuyển sang hai môi trường thạch chọn lọc: Thạch xylose lysine deoxycholate (XLD) và một môi trường thạch chọn lọc bổ sung khác (ví dụ: thạch BGA hoặc thạch chromogenic thích hợp cho Salmonella). Các đĩa thạch được ủ ở 37 độ C để phát hiện các khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella.
• Giai đoạn 4: Khẳng định (Confirmation) - Các khuẩn lạc nghi ngờ từ các đĩa thạch chọn lọc được chọn để tiến hành khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa (như khả năng phân giải đường, sinh H2S, urease, lysine decarboxylase) và thử nghiệm huyết thanh học (kháng nguyên O và H) theo quy định tại TCVN 10780-1.
• Tính toán kết quả (Calculation): Dựa trên số lượng các giếng dương tính đã được khẳng định ở mỗi độ pha loãng, tiến hành tra bảng MPN thu nhỏ để tính toán số lượng Salmonella có xác suất lớn nhất trong một gam hoặc một mililit mẫu thử ban đầu.