Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9045:2012 (hoàn toàn tương đương với EN 15652:2009) quy định phương pháp xác định hàm lượng niacin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Dưới đây là tóm tắt chi tiết các nội dung cốt lõi từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này, bao gồm phạm vi áp dụng, tài liệu viện dẫn, nguyên tắc xác định và các yêu cầu về hóa chất, thuốc thử.

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng niacin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Niacin được xác định dưới dạng tổng số của axit nicotinic và nicotinamit, sau đó được biểu thị bằng miligam axit nicotinic trên 100g thực phẩm.
• Phương pháp này đã được thử nghiệm liên phòng thử nghiệm trên nhiều loại ma trận thực phẩm khác nhau, bao gồm ngũ cốc, sữa bột, thịt, và các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng, đảm bảo tính chính xác và độ lặp lại cao.

• Các tài liệu viện dẫn sau đây là bắt buộc để áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
• TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

• Quá trình thủy phân: Niacin (axit nicotinic và nicotinamit) có trong mẫu thực phẩm được giải phóng bằng cách thủy phân bằng axit (thường là axit clohydric hoặc axit sunfuric loãng) ở nhiệt độ cao (ví dụ: hấp áp lực hoặc đun hồi lưu).
• Xử lý enzym (nếu cần): Đối với một số ma trận thực phẩm phức tạp chứa liên kết niacin khó phân hủy (như ngũ cốc), mẫu sau thủy phân axit có thể được xử lý bằng enzym thích hợp (như diastase hoặc amylase) để chuyển hóa hoàn toàn các dạng liên kết thành dạng tự do.
• Phân tích HPLC: Dịch lọc sau khi làm sạch được tiến hành phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Việc tách được thực hiện trên cột pha đảo (C18 hoặc tương đương).
• Phát hiện và định lượng: Hàm lượng niacin được phát hiện bằng đầu dò tử ngoại (UV) ở bước sóng thích hợp (thường là 260 nm) hoặc đầu dò huỳnh quang sau khi dẫn xuất hóa sau cột (post-column derivatization) để tăng độ nhạy. Việc định lượng dựa trên phương pháp ngoại chuẩn so với đường chuẩn của axit nicotinic và nicotinamit tinh khiết.

• Yêu cầu chung: Tất cả các hóa chất được sử dụng phải thuộc loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng phải đạt tiêu chuẩn loại 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc có độ tinh khiết tương đương.
• Chất chuẩn: Axit nicotinic (độ tinh khiết tối thiểu 99%) và Nicotinamit (độ tinh khiết tối thiểu 99%). Các chất chuẩn này cần được bảo quản tránh ánh sáng và độ ẩm.
• Dung dịch chuẩn gốc: Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc axit nicotinic và nicotinamit trong nước hoặc dung dịch đệm thích hợp với nồng độ xác định (ví dụ: 1 mg/ml), bảo quản ở nhiệt độ lạnh (khoảng 4 độ C) và tránh ánh sáng.
• Dung dịch chuẩn làm việc: Được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc bằng pha động hoặc dung dịch thích hợp ngay trước khi sử dụng để xây dựng đường chuẩn sắc ký.
• Hóa chất thủy phân và điều chỉnh pH: Axit clohydric (HCl) hoặc axit sunfuric (H2SO4) nồng độ thích hợp cho quá trình thủy phân; dung dịch natri hydroxit (NaOH) hoặc natri axetat để điều chỉnh pH của dịch chiết về khoảng tối ưu cho quá trình phân tích sắc ký hoặc xử lý enzym.
• Enzym (nếu áp dụng): Chế phẩm enzym diastase hoặc amylase hoạt tính cao, không chứa hoặc chứa lượng niacin không đáng kể (cần tiến hành thử mẫu trắng để kiểm tra hàm lượng niacin trong enzym).
• Pha động cho HPLC: Hỗn hợp của dung dịch đệm axetat hoặc photphat với dung môi hữu cơ (như metanol hoặc axetonitril) được lọc qua màng lọc 0,45 µm và đuổi khí trước khi sử dụng. Có thể bổ sung chất tạo cặp ion (như natri octansulfonat) tùy thuộc vào loại cột và điều kiện sắc ký cụ thể.