Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9044:2012 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn châu Âu EN 15607:2009. Đây là tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng d-biotin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Dưới đây là tóm tắt chi tiết các nội dung cốt lõi từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

Điều 1: Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định phần khối lượng d-biotin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này đã được nghiên cứu cộng tác và xác nhận giá trị sử dụng trên nhiều loại nền mẫu thực phẩm khác nhau, bao gồm cả các mẫu có bổ sung và không bổ sung d-biotin như:

• Sữa bột công thức dành cho trẻ em và sữa bột dinh dưỡng.
• Các sản phẩm thực phẩm chế biến sẵn như súp gà đóng hộp, đậu xanh hầm thịt.
• Các dạng thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng và thực phẩm bảo vệ sức khỏe khác.

Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây là bắt buộc và không thể thiếu khi áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung:

• TCVN 4851 (ISO 3696) - Nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp

Quy trình phân tích d-biotin trong thực phẩm theo tiêu chuẩn này dựa trên các nguyên tắc kỹ thuật nghiêm ngặt sau:

• Giải phóng d-biotin: D-biotin liên kết trong cấu trúc nền mẫu thực phẩm phức tạp được giải phóng bằng phương pháp thủy phân bằng enzym (thường sử dụng papain hoặc các hỗn hợp enzym thích hợp) hoặc thủy phân bằng axit nhẹ để phá vỡ các liên kết protein-biotin mà không làm phân hủy hoạt chất.
• Làm sạch mẫu bằng cột ái lực miễn dịch (IAC): Dịch chiết sau khi thủy phân được lọc và làm sạch bằng cách cho đi qua cột ái lực miễn dịch chứa các kháng thể đặc hiệu kháng d-biotin. D-biotin được giữ lại trên cột nhờ liên kết kháng nguyên - kháng thể, trong khi các tạp chất khác bị rửa trôi hoàn toàn. Sau đó, d-biotin được rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi thích hợp (như hỗn hợp methanol/nước).
• Xác định bằng HPLC: Hàm lượng d-biotin trong dịch rửa giải được xác định bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Quá trình phát hiện được thực hiện bằng đầu dò huỳnh quang sau khi thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất sau cột (post-column derivatization) hoặc sử dụng các kỹ thuật phát hiện tương đương để đảm bảo độ nhạy và độ chọn lọc tối ưu.

Điều 4: Hóa chất, thuốc thử và vật liệu

Để đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại của phép đo, tất cả các hóa chất và thuốc thử được sử dụng phải đạt độ tinh khiết phân tích. Nước sử dụng phải là nước loại 1 theo tiêu chuẩn TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc có chất lượng tương đương:

• Chất chuẩn d-biotin: Có độ tinh khiết tối thiểu 99%, được bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng và nhiệt độ thấp để tránh phân hủy.
• Dung dịch đệm và dung môi: Bao gồm dung dịch đệm phosphat (PBS) để duy trì pH tối ưu cho quá trình liên kết ái lực miễn dịch, methanol cấp dùng cho sắc ký (HPLC grade), và các hóa chất pha động khác.
• Enzym thủy phân: Papain hoặc các chế phẩm enzym thương mại có hoạt tính phù hợp để giải phóng biotin hiệu quả từ cấu trúc nền mẫu thực phẩm phức tạp.
• Cột ái lực miễn dịch (IAC): Cột chứa kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đặc hiệu với d-biotin, có khả năng liên kết và thu hồi tối đa lượng biotin có trong dịch chiết mẫu.