Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7686:2007 (ISO 16654:2001)

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7686:2007 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 16654:2001, quy định phương pháp chuẩn để phát hiện vi sinh vật Escherichia coli O157 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Đây là một trong những văn bản kỹ thuật cốt lõi phục vụ công tác kiểm nghiệm an toàn sinh học thực phẩm, giúp phát hiện sớm chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tố nguy hiểm cho sức khỏe con người. Dưới đây là tóm tắt chi tiết nội dung từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

Điều 1: Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp kiểm nghiệm chung (phương pháp chuẩn) nhằm phát hiện vi khuẩn Escherichia coli O157 có trong các nhóm đối tượng sau:

• Các sản phẩm thực phẩm phục vụ cho mục đích tiêu dùng của con người.
• Các sản phẩm thức ăn chăn nuôi dành cho gia súc, gia cầm và các loài động vật khác.
• Các mẫu môi trường thu thập tại khu vực sản xuất, chế biến, bảo quản và phân phối thực phẩm.

Do tính chất độc lực cao của chủng vi khuẩn E. coli O157 (đặc biệt là khả năng gây hội chứng tán huyết tăng urê máu nguy hiểm), tiêu chuẩn cũng khuyến cáo các phòng thử nghiệm phải tuân thủ nghiêm ngặt các quy định về an toàn sinh học khi vận hành quy trình phân tích này.

Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác và đồng bộ, cần phối hợp sử dụng các tài liệu viện dẫn tiêu chuẩn chất lượng sau đây (đối với các tài liệu ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu, đối với tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất):

• TCVN 6404 (ISO 7218) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật.
• Các phần liên quan của TCVN 6507 (ISO 6887) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.

Điều 3: Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn đưa ra định nghĩa kỹ thuật rõ ràng đối với đối tượng kiểm nghiệm nhằm tránh nhầm lẫn trong quá trình phân tích:

• Escherichia coli O157: Được định nghĩa là những vi sinh vật hình thành các khuẩn lạc điển hình trên bề mặt môi trường thạch chọn lọc được chỉ định (cụ thể là thạch MacConkey Sorbitol có bổ sung Cefixime và Tellurite - ký hiệu là CT-SMAC).
• Các khuẩn lạc này có đặc tính sinh hóa đặc trưng là không lên men sorbitol (thể hiện qua việc khuẩn lạc không màu hoặc có màu vàng rơm nhạt trên môi trường CT-SMAC).
• Các khuẩn lạc nghi ngờ phải cho phản ứng sinh indol dương tính và bắt buộc phải có phản ứng ngưng kết đặc hiệu với kháng huyết thanh kháng kháng nguyên O157 của vi khuẩn E. coli (hoặc các hạt latex được phủ kháng thể kháng O157).

Điều 4: Nguyên tắc của phương pháp phát hiện

Quy trình phát hiện Escherichia coli O157 theo tiêu chuẩn này được thiết kế qua 4 giai đoạn liên tiếp nhằm tối ưu hóa khả năng tìm thấy vi khuẩn mục tiêu ngay cả khi chúng hiện diện với mật độ rất thấp hoặc bị tổn thương trong mẫu thử:

• Giai đoạn 1 - Tăng sinh (Enrichment): Mẫu thử được đồng nhất và nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc là canh thang Tryptone Soya cải tiến có bổ sung Novobiocin (mTSB + N). Quá trình ủ ấm được thực hiện ở nhiệt độ từ 41,5 độ C đến 42 độ C trong khoảng thời gian từ 6 giờ đến 24 giờ. Nhiệt độ cao này giúp ức chế hiệu quả các vi khuẩn tạp nhiễm khác và thúc đẩy sự phát triển của E. coli O157.
• Giai đoạn 2 - Tách biệt bằng hạt từ miễn dịch (Immunomagnetic Separation - IMS): Đây là bước kỹ thuật tiên tiến giúp làm giàu và cô đặc vi khuẩn mục tiêu. Các hạt từ tính được phủ kháng thể kháng E. coli O157 được đưa vào dịch nuôi cấy tăng sinh để bắt giữ đặc hiệu các tế bào vi khuẩn O157, sau đó tách chúng ra khỏi dịch nền bằng hệ thống nam châm chuyên dụng.
• Giai đoạn 3 - Cấy phân lập trên môi trường thạch chọn lọc (Plating out): Hỗn hợp hạt từ thu được sau quá trình IMS được cấy phân lập lên đĩa môi trường thạch CT-SMAC và một môi trường thạch chọn lọc thứ hai do phòng thử nghiệm tự lựa chọn (ví dụ: thạch tương tác màu). Các đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ để tìm kiếm các khuẩn lạc nghi ngờ.
• Giai đoạn 4 - Khẳng định (Confirmation): Các khuẩn lạc nghi ngờ không lên men sorbitol trên đĩa thạch sẽ được chọn lọc để tiến hành các thử nghiệm khẳng định bao gồm: thử nghiệm khả năng sinh indol (đặc trưng sinh hóa) và thử nghiệm ngưng kết huyết thanh học với kháng thể kháng O157 (đặc trưng kháng nguyên).