TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12629:2019

NGŨ CỐC - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BETA-D-GLUCAN - PHƯƠNG PHÁP ENZYME

Cereals - Determination of β-D-glucan by enzymatic method

Lời nói đầu

TCVN 12629:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 995.16 β-D-Glucan in Oats. Streamlined Enzymatic Method;

TCVN 12629:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

NGŨ CỐC - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BETA-D-GLUCAN - PHƯƠNG PHÁP ENZYME

Cereals - Determination of β-D-glucan by enzymatic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng β-D-glucan trong ngũ cốc bằng đo quang sau khi sử dụng enzym.

Phương pháp này có thể áp dụng đối với ngũ cốc nguyên hạt và sản phẩm từ ngũ cốc dạng bột, dạng mảnh.

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

2  Nguyên tắc

(1→3)(1→4)-β-D-Glucan được thủy phân đặc hiệu bởi lichenase tạo thành các oligosaccharide và chúng được phân cắt tiếp thành glucose bởi β-glucosidase. Glucose được định lượng, sử dụng hỗn hợp đệm peroxidase /oxidase glucose.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải là nước cất, trừ khi có quy định khác.

3.1  Dung dịch lichenase, 50 U/ml

Pha loãng 1 ml dung dịch lichenase - amoni sulfat thành 20 ml bằng dung dịch đệm phosphat 20 mM (3.5). Chia dung dịch enzym thành các phần 5 ml và bảo quản đông lạnh trong các ống polypropylen để phòng ngừa nhiễm vi sinh vật. Huyền phù lichenase - amoni sulfat không pha loãng, ổn định 6 năm khi được bảo quản ở 4 °C.

CHÚ THÍCH: Một đơn vị (U) hoạt độ enzym là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 µM glucose trong 1 min từ β-glucan lúa mạch (10 mg/ml) ở pH 6,5 và nhiệt độ 40 °C.

3.2  Dung dịch β-glucosidase, 2 U/ml

Pha loãng 1 ml dung dịch β-glucosidase - amoni sulfat thành 20 ml bằng dung dịch đệm axetat 50 mM (3.6.2). Chia dung dịch enzym thành các phần 5 ml và bảo quản đông lạnh trong các ống polypropylen để phòng ngừa nhiễm vi sinh vật. Huyền phù β-glucosidase - amoni sulfat không pha loãng, ổn định 6 năm khi được bảo quản ở 4 °C.

Kiểm tra độ tinh khiết của các enzym: tiến hành các bước được nêu trong 5.1 đến 5.3, sử dụng tinh bột ngô (3.8) làm phần mẫu thử. Hàm lượng β-D-glucan phải là 0 % (độ hấp thụ quang của chất phân tích bằng độ hấp thụ quang của mẫu trắng thuốc thử).

Kiểm tra hoạt độ enzym của từng lô lichenase và β-glucosidase: sử dụng mẫu bột chuẩn (3.9). Kiểm tra độ tinh khiết của β-glucosidase bằng cách ủ enzym này với hỗn hợp phản ứng lichenase từ 5.3.6 (sử dụng 0,1 ml cho mỗi quy trình định lượng chuẩn thử nghiệm chuẩn) đối với khoảng thời gian bổ sung (nghĩa là tăng lên một vài giờ thay vì 10 min).

3.3  Dung dịch hỗn hợp đệm glucose oxidase/peroxidase

3.3.1  Dung dịch hỗn hợp đệm đậm đặc

Hòa tan 13,6 g kali dihydro phosphat (KH₂PO₄), 4,2 g natri hydroxit (NaOH) và 3,0 g axit 4-hydroxybenzoic trong 96 ml nước. Chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch axit clohydric 2 M (16,7 ml/100 ml) hoặc natri hydroxit 2 M (8,0 g/100 ml). Định mức dung dịch đến 100 ml, thêm 0,4 g natri azide, trộn đều đến khi tan hết. Dung dịch hỗn hợp đệm đậm đặc bền đến 3 năm ở 4 °C.

3.3.2  Dung dịch hỗn hợp đệm làm việc, nồng độ tương ứng: glucose oxidase > 12000 U/L, peroxidase > 650 U/L và 4-aminoantipyrine 0,4 mM (81,3 mg/l)

Pha loãng 50 ml dung dịch hỗn hợp đệm đậ