TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9049 : 2012

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM BOTULINUM VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH

Foodstuffs – Determination of Clostridium botulinum and its toxins by microbiological method

Lời nói đầu

TCVN 9049:2012 được xây dựng dựa trên cơ sở AOAC 977.26 Clostridium botulinum and Its Toxins in Foods. Microbiological Method;

TCVN 9049:2012 do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm tổ chức biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM BOTULINUM VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH

Foodstuffs – Determination of Clostridium botulinum and its toxins by microbiological method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định Clostridium botulinum và các độc tố của chúng trong thực phẩm bằng phương pháp vi sinh.

2. Nguyên tắc

Dịch chiết từ thực phẩm chứa một liều tối thiểu gây chết (MLD) từ độc tố botulinum được tiêm vào phúc mạch chuột, con vật sẽ chết trong vòng 48 h sau khi có biểu hiện tuần tự các triệu chứng nhiễm độc botulinum. Kháng độc tố tương đồng sẽ bảo vệ chuột khỏi các triệu chứng đó, trong khi các kháng độc tố khác lại không, dựa vào đó để xác định typ huyết thanh. Các bào tử sống trong thực phẩm sẽ phát triển trong môi trường nuôi cấy thích hợp và sinh độc tố, các độc tố này được phát hiện và định typ.

3. Thuốc thử và môi trường

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1. Canh thang từ thịt và từ gan, vô trùng

3.1.1 Canh thang gan

Nghiền nhỏ 500 g gan bò tươi trong 800 ml nước. Đun đến sôi và để trong 1 h. Để nguội, chỉnh pH đến 7,0 và đun sôi trong 10 min. Lọc qua vải thưa, ép loại bỏ phần chất lỏng. Cho vào canh thang này 10  g pepton, 1 g dikali hydrophosphat (K₂HPO₄) và 1 g tinh bột hòa tan. Chỉnh đến pH 7,0 và pha loãng bằng nước đến 1 lít. Lọc qua giấy thô. Canh thang này có thể bảo quản riêng rẽ trong tủ lạnh để sử dụng sau này, nếu cần. Phân phối vào các ống nghiệm kích thước 18 mm x 150 mm hoặc  20 mm x 150 mm, lượng gan với chiều cao từ 1 cm đến 2 cm và chất lỏng từ 10 ml đến 12 ml. Hấp áp lực 20 min ở 121 °C.

3.1.2. Canh thang thịt

Có thể sử dụng canh thang có bán sẵn trên thị trường có thành phần sau: 454 g tim bò, 20 g pepton proteoza, 2g dextroza và 5 g natri clorua. Hòa 12,5 g môi trường này vào 100 ml nước lạnh. Trộn kỹ và để yên cho đến khi các hạt đã thấm kỹ nước (khoảng 15 min). Cách khác, thêm 1,25 g môi trường đặc vào các ống nghiệm, thêm 10 ml nước lạnh và trộn kỹ cho đến khi các hạt thấm ướt nước. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng phải là 7,2 ± 0,1.

3.2. Canh thang dịch chiết nấm men trypticaza-pepton-glucoza (TPGY) hoặc TPGY với trypsin (TPGYT)

Chỉ sử dụng TPGYT để thay thế khi vi sinh vật nghi ngờ thuộc chủng của typ B, E, hoặc F không phân giải protein. Hòa tan 50 g trypticaza, 5g bacto-pepton, 20 g chất chiết nấm men, 4 g dextroza và 1 g natri thioglycollat trong 1 lít nước và phân phối với các lượng 15 ml vào các ống nghiệm đựng môi trường kích thước 20 mm x 150 mm hoặc các lượng 100 ml vào các chai đựng quy định. Hấp áp lực 10 min đối với ống nghiệm hoặc 15 min đối với chai đựng ở 121 °C. pH cuối cùng phải là 7,2 ± 0,1. Bảo quản trong tủ lạnh và loại bỏ nếu không được sử dụng trong vòng 2 tuần. Ngay trước sử dụng, đun sôi hoặc hấp để loại bỏ oxi và làm nguội nhanh, sau đó bằng cách vô trùng thêm 1,0 ml dung dịch trypsin cho mỗi 15 ml canh thang.

Chuẩn bị dung dịch trypsin bằng cách hòa tan 1,5 g trypsin trong 100 ml nước. Khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 mm hoặc tương đương và để trong tủ lạnh.

3.3. Thạch lòng đỏ trứng-thịt