Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8764:2012 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 13903:2005, quy định phương pháp xác định hàm lượng các axit amin tự do và liên kết trong thức ăn chăn nuôi. Dưới đây là phần tóm tắt chi tiết và chuyên sâu về phạm vi áp dụng, tài liệu viện dẫn, nguyên tắc thử nghiệm và các yêu cầu hóa chất từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định các axit amin tự do và liên kết trong thức ăn chăn nuôi bằng cách sử dụng thiết bị phân tích axit amin chuyên dụng hoặc thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Phương pháp này được áp dụng cụ thể để định lượng các axit amin bao gồm: cyst(e)ine, methionine, lysine, threonine, alanine, arginine, axit aspartic, axit glutamic, glycine, histidine, isoleucine, leucine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine và valine.
• Tiêu chuẩn lưu ý rằng phương pháp này không thể phân biệt được giữa các muối của axit amin, cũng như không phân biệt được các dạng đồng phân D và L của axit amin.
• Phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này không áp dụng để xác định hàm lượng tryptophan trong thức ăn chăn nuôi.

• Việc áp dụng tiêu chuẩn này đòi hỏi phải viện dẫn tài liệu kỹ thuật cốt lõi là TCVN 6952 (ISO 6498) về Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.
• Yêu cầu bắt buộc là quy trình chuẩn bị mẫu thử phải tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn viện dẫn nêu trên để đảm bảo tính đồng nhất, đại diện và không làm biến đổi hàm lượng axit amin trước khi tiến hành phân tích hóa lý.

• Xác định các axit amin tự do: Các axit amin tự do được chiết tách ra khỏi mẫu bằng dung dịch axit clohydric loãng. Các protein hòa tan đồng chiết sẽ được kết tủa bằng axit sulfosalicylic và loại bỏ hoàn toàn bằng phương pháp lọc. Sau đó, trị số pH của dịch lọc được điều chỉnh chính xác về mức 2,20. Các axit amin được tách bằng thiết bị phân tích axit amin hoặc HPLC, rồi tiến hành định lượng bằng cách đo ở bước sóng thích hợp sau khi phản ứng với ninhydrin hoặc chất tạo dẫn xuất khác.
• Xác định các axit amin liên kết (tổng số axit amin): Quy trình thực hiện được phân tách rõ ràng tùy thuộc vào đặc tính hóa học của từng nhóm axit amin cần xác định.
• Đối với nhóm cyst(e)ine và methionine: Mẫu thử bắt buộc phải được oxy hóa bằng axit performic ở nhiệt độ thấp (từ 0 độ C đến 5 độ C) trước khi tiến hành thủy phân. Quá trình này nhằm chuyển hóa cyst(e)ine và methionine tương ứng thành cysteic acid và methionine sulfone ổn định. Lượng axit performic dư thừa sau phản ứng được phân hủy bằng natri disulfit. Tiếp theo, mẫu được thủy phân bằng dung dịch axit clohydric nồng độ 6 mol/l trong thời gian 23 giờ. Dịch thủy phân sau đó được điều chỉnh pH về 2,20 trước khi đưa vào hệ thống sắc ký để tách và định lượng.
• Đối với nhóm lysine, threonine và các axit amin khác: Mẫu thử được tiến hành thủy phân trực tiếp bằng dung dịch axit clohydric nồng độ 6 mol/l trong thời gian 23 giờ dưới môi trường khí quyển trơ hoặc đun hồi lưu liên tục. Trị số pH của dịch thủy phân sau đó cũng được điều chỉnh về mức 2,20 trước khi tiến hành phân tích sắc ký.
• Lưu ý đặc biệt đối với tyrosine: Hàm lượng tyrosine phải được xác định riêng biệt từ dịch thủy phân của mẫu không qua quá trình oxy hóa, do tyrosine rất dễ bị phá hủy một phần dưới tác động của axit performic.

• Tiêu chuẩn yêu cầu tất cả các hóa chất, thuốc thử được sử dụng trong quá trình phân tích phải đạt độ tinh khiết phân tích cao. Nước sử dụng phải là nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương (nước khử khoáng siêu sạch).
• Chất chuẩn axit amin: Phải chuẩn bị đầy đủ các chất chuẩn tinh khiết của từng loại axit amin cần đo, bao gồm cả dạng dẫn xuất như cysteic acid và methionine sulfone để phục vụ công tác lập đường chuẩn và định lượng.
• Axit clohydric (HCl): Cần chuẩn bị các nồng độ khác nhau, đặc biệt là dung dịch HCl nồng độ khoảng 6 mol/l có bổ sung phenol (nhằm bảo vệ tyrosine không bị halogen hóa trong quá trình thủy phân) và dung dịch HCl loãng nồng độ 0,1 mol/l dùng cho quá trình chiết axit amin tự do.
• Axit sulfosalicylic: Sử dụng dung dịch nồng độ khoảng 6% (khối lượng/thể tích) làm tác nhân kết tủa protein hòa tan.
• Axit performic: Phải được điều chế mới ngay trước khi sử dụng bằng cách phối trộn axit formic với hydro peroxit (oxy già) và phenol theo tỷ lệ quy định để đảm bảo hoạt tính oxy hóa tối ưu.
• Natri disulfit (Na2S2O5): Sử dụng làm chất khử để loại bỏ hoàn toàn lượng axit performic dư thừa sau giai đoạn oxy hóa mẫu.
• Dung dịch đệm điều chỉnh pH: Sử dụng dung dịch đệm natri citrat hoặc các hệ đệm chuyên dụng khác có khả năng duy trì và ổn định trị số pH ở mức chính xác 2,20 trước khi bơm mẫu vào hệ thống cột sắc ký.