Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12320:2018 về Bia - Xác định hàm lượng nitơ amin tự do - Phương pháp quang phổ (trong một số danh mục ghi nhận là phương pháp quang thổ) được ban hành bởi Bộ Khoa học và Công nghệ nhằm quy định phương pháp thử nghiệm đồng bộ, chính xác để xác định hàm lượng nitơ amin tự do trong các sản phẩm bia.

Phạm vi và đối tượng áp dụng của tiêu chuẩn

• Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng nitơ amin tự do (Free Amino Nitrogen - FAN) trong bia thành phẩm, bao gồm cả bia hơi, bia chai, bia lon, bia tươi và các dạng dịch đường hóa (wort) trong quá trình sản xuất bia.
• Đối tượng áp dụng: Áp dụng đối với các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm tra chất lượng sản phẩm, các tổ chức chứng nhận hợp chuẩn hợp quy, cùng các doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh và nhập khẩu bia tại Việt Nam.

Nguyên lý của phương pháp xác định

• Phương pháp dựa trên phản ứng hóa học giữa các axit amin tự do, peptit nhỏ và các hợp chất chứa nhóm amin khác có trong bia với thuốc thử ninhydrin ở môi trường pH thích hợp (thường duy trì ở pH từ 6,7 đến 6,8) dưới tác dụng của nhiệt độ cao (đun cách thủy sôi).
• Sản phẩm của phản ứng tạo ra phức chất màu xanh tím (màu tía Ruhemann) có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 570 nm.
• Độ hấp thụ quang của dung dịch sau phản ứng tỷ lệ thuận với hàm lượng nitơ amin tự do có trong mẫu, được xác định thông qua việc đo phổ hấp thụ và đối chiếu với đường chuẩn được xây dựng từ dung dịch chuẩn glycine.

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất yêu cầu

• Thiết bị và dụng cụ: Máy đo quang phổ (Spectrophotometer) có khả năng đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 nm; bể điều nhiệt (bể cách thủy) có khả năng duy trì nhiệt độ sôi ổn định; các dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn đo lường như bình định mức, pipet chính xác, ống nghiệm có nắp vặn chịu nhiệt.
• Hóa chất và thuốc thử: Ninhydrin tinh khiết phân tích; fructose; kali dihydro photphat (KH2PO4) và natri hydro photphat (Na2HPO4) dùng để pha dung dịch đệm; glycine dùng làm chất chuẩn chính; nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (không chứa amoniac).

Quy trình tiến hành thử nghiệm chi tiết

• Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành loại bỏ hoàn toàn khí carbon dioxide (CO2) ra khỏi mẫu bia bằng phương pháp lắc hoặc lọc qua giấy lọc gấp nếp. Sau đó, thực hiện pha loãng mẫu bia bằng nước cất theo tỷ lệ thích hợp để hàm lượng nitơ amin tự do nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn.
• Phản ứng tạo màu: Hút một thể tích mẫu đã pha loãng (hoặc dung dịch chuẩn, hoặc nước cất đối với mẫu trắng) vào ống nghiệm. Thêm dung dịch đệm photphat và thuốc thử ninhydrin vào ống nghiệm, đậy kín nắp và trộn đều.
• Gia nhiệt và làm nguội: Đặt các ống nghiệm vào bể cách thủy sôi và giữ đúng trong khoảng thời gian quy định (thường là 16 phút). Sau đó, lấy ra và làm nguội nhanh về nhiệt độ phòng (khoảng 20 độ C đến 25 độ C) bằng cách ngâm trong bể nước lạnh để dừng phản ứng.
• Đo độ hấp thụ quang: Thêm dung dịch pha loãng (thường là dung dịch kali iodat hoặc cồn) vào ống nghiệm để ổn định màu sắc của phức chất. Tiến hành đo độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn ở bước sóng 570 nm so với mẫu trắng trong vòng thời gian quy định sau khi làm nguội.

Tính toán và biểu thị kết quả thử nghiệm

• Hàm lượng nitơ amin tự do (FAN) trong mẫu bia được tính toán bằng miligam trên lít (mg/l) dựa trên công thức liên hệ giữa độ hấp thụ quang của mẫu thử, độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn glycine và hệ số pha loãng của mẫu.
• Kết quả thử nghiệm cuối cùng là trị số trung bình của ít nhất hai phép xác định song song được tiến hành trên cùng một mẫu thử, đảm bảo sai số giữa hai lần đo nằm trong giới hạn cho phép của tiêu chuẩn.

Hiệu lực thi hành và áp dụng

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12320:2018 có hiệu lực kể từ ngày ban hành. Việc áp dụng tiêu chuẩn này giúp các đơn vị kiểm nghiệm và nhà sản xuất kiểm soát chặt chẽ hàm lượng dinh dưỡng nitơ amin tự do trong bia, một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men của nấm men và chất lượng cảm quan của sản phẩm bia thành phẩm.