Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12104:2018 về Vi sinh vật giải xenlulo - Xác định hoạt độ xenlulaza được công bố nhằm thống nhất phương pháp xác định hoạt độ enzym xenlulaza sinh ra từ các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo. Tiêu chuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá chất lượng các chế phẩm sinh học, phân bón vi sinh và phục vụ công tác nghiên cứu khoa học liên quan đến công nghệ sinh học tại Việt Nam.

Phạm vi và đối tượng áp dụng của tiêu chuẩn

• Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hoạt độ enzym xenlulaza (cellulase) của các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo hoặc các chế phẩm vi sinh vật có chứa các chủng này.
• Đối tượng áp dụng: Áp dụng đối với các phòng thử nghiệm, tổ chức khoa học công nghệ, doanh nghiệp sản xuất kinh doanh chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ vi sinh và các cơ quan quản lý nhà nước tiến hành kiểm tra chất lượng sản phẩm liên quan.

Nguyên tắc xác định hoạt độ xenlulaza

• Phương pháp dựa trên sự thủy phân cơ chất xenlulo (như carboxymethyl cellulose - CMC) bởi enzym xenlulaza dưới các điều kiện nhiệt độ và pH xác định trong một khoảng thời gian cụ thể.
• Lượng đường khử giải phóng ra sau quá trình thủy phân được xác định bằng phương pháp so màu với thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS).
• Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với lượng đường khử tạo thành, từ đó tiến hành đo độ hấp thụ quang để tính toán hoạt độ enzym.

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất yêu cầu

• Thiết bị và dụng cụ: Máy đo quang phổ có khả năng đo ở bước sóng 540 nm, bể điều nhiệt duy trì nhiệt độ ổn định, máy lắc, cân phân tích có độ chính xác cao, tủ ấm, và các dụng cụ thủy tinh chuyên dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh.
• Hóa chất và môi trường: Cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC), thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS), dung dịch đệm citrat hoặc đệm photphat phù hợp, glucose tinh khiết để xây dựng đường cong chuẩn.

Quy trình tiến hành thử nghiệm chi tiết

• Chuẩn bị dịch enzym: Tiến hành ly tâm hoặc lọc dịch nuôi cấy vi sinh vật giải xenlulo để thu được dịch siêu ly tâm trong suốt chứa enzym ngoại bào cần xác định.
• Phản ứng thủy phân cơ chất: Phối trộn một thể tích dịch enzym xác định với dung dịch cơ chất CMC trong dung dịch đệm thích hợp, sau đó tiến hành ủ trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ và thời gian quy định.
• Phát triển màu phản ứng: Thêm thuốc thử DNS vào hỗn hợp sau khi ủ để dừng phản ứng thủy phân, tiến hành đun sôi cách thủy trong khoảng thời gian quy định để tạo màu phức chất, sau đó làm nguội nhanh về nhiệt độ phòng.
• Đo độ hấp thụ quang: Tiến hành đo trị số mật độ quang (OD) của hỗn hợp ở bước sóng 540 nm so với mẫu trắng (mẫu đối chứng không có hoạt tính enzym).

Tính toán và biểu thị kết quả hoạt độ

• Xây dựng đường chuẩn: Sử dụng các dung dịch glucose chuẩn với các nồng độ khác nhau để phản ứng với thuốc thử DNS, đo OD và vẽ đường cong chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ glucose và mật độ quang.
• Định nghĩa đơn vị hoạt độ: Một đơn vị hoạt độ xenlulaza (U) được định nghĩa là lượng enzym giải phóng ra 1 micromol đường khử (tính theo glucose) trong thời gian một phút dưới các điều kiện thử nghiệm tiêu chuẩn.
• Công thức tính toán: Hoạt độ enzym được tính toán dựa trên lượng đường khử quy đổi từ đường chuẩn, thể tích dịch enzym sử dụng, thời gian phản ứng thủy phân và hệ số pha loãng của mẫu thử.

Hiệu lực thi hành của tiêu chuẩn

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12104:2018 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày ban hành. Các tổ chức, cá nhân hoạt động trong lĩnh vực thử nghiệm vi sinh vật giải xenlulo có trách nhiệm tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình kỹ thuật được hướng dẫn trong tiêu chuẩn này để đảm bảo tính chính xác, khách quan và thống nhất của kết quả phân tích.