Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11476:2016 quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng naringin và neohesperidin trong nước quả. Đây là những hợp chất flavonoid đặc trưng, đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá chất lượng, độ nguyên chất cũng như phát hiện các hành vi pha trộn thương mại trong các sản phẩm nước quả, đặc biệt là các loại quả thuộc chi Cam chanh (Citrus).

Dưới đây là phần tóm tắt chi tiết và chuyên sâu nội dung từ Điều 1 đến Điều 4 của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11476:2016:

- Điều 1: Phạm vi áp dụng

Điều khoản này xác định giới hạn kỹ thuật và đối tượng điều chỉnh của tiêu chuẩn:

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng của hai hợp chất flavonoid chính là naringin và neohesperidin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Đối tượng áp dụng trực tiếp bao gồm các loại nước quả, nước quả cô đặc đã hoàn nguyên và các sản phẩm nước quả liên quan lưu thông trên thị trường.
• Phương pháp này là công cụ kỹ thuật quan trọng giúp các cơ quan kiểm nghiệm và nhà sản xuất kiểm soát chất lượng sản phẩm, xác minh nguồn gốc xuất xứ và phát hiện việc pha trộn không hợp pháp (ví dụ: phát hiện sự có mặt của nước bưởi trong nước cam).

- Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác và đồng bộ, việc viện dẫn các tài liệu kỹ thuật liên quan là bắt buộc:

• Các tài liệu viện dẫn trong tiêu chuẩn này là nền tảng để thực hiện các bước chuẩn bị mẫu, hiệu chuẩn thiết bị và xử lý số liệu.
• Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
• Các tài liệu liên quan chủ yếu bao gồm tiêu chuẩn về lấy mẫu nước quả, tiêu chuẩn về nước dùng trong phòng thử nghiệm phân tích và các tiêu chuẩn về dung môi, hóa chất dùng cho phân tích sắc ký.

- Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp

Nguyên tắc phân tích của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đối với naringin và neohesperidin được quy định cụ thể như sau:

• Chuẩn bị và tiền xử lý mẫu: Mẫu thử là nước quả được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ thích hợp (thường là màng lọc 0,45 micromet) để loại bỏ hoàn toàn các tạp chất lơ lửng, tránh gây tắc nghẽn hệ thống sắc ký. Đối với các mẫu nước quả cô đặc, cần tiến hành pha loãng bằng nước hoặc dung môi pha động theo tỷ lệ quy định trước khi lọc.
• Phân tách sắc ký: Dung dịch mẫu sau khi lọc được bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Quá trình phân tách naringin và neohesperidin ra khỏi các thành phần khác trong mẫu được thực hiện trên cột sắc ký pha đảo (RP-HPLC, thông thường sử dụng cột C18). Quá trình rửa giải có thể được tiến hành theo phương pháp đẳng dòng (isocratic) hoặc rửa giải theo chương trình dung môi (gradient) tùy thuộc vào cấu hình thiết bị và yêu cầu phân tách.
• Phát hiện và định lượng: Các chất sau khi tách ra khỏi cột được phát hiện bằng detector quang phổ tử ngoại (UV) hoặc detector mảng diod (DAD) ở bước sóng hấp thụ cực đại thích hợp (thường ở bước sóng khoảng 280 nm đến 285 nm). Hàm lượng naringin và neohesperidin trong mẫu được tính toán dựa trên diện tích pic hoặc chiều cao pic thu được so với đường chuẩn của các chất chuẩn tương ứng.

- Điều 4: Thuốc thử và vật liệu thử

Tiêu chuẩn đưa ra các yêu cầu nghiêm ngặt về độ tinh khiết của hóa chất, dung môi và chất chuẩn để đảm bảo độ lặp lại và độ tái lập của phép đo:

• Yêu cầu chung về hóa chất: Tất cả các hóa chất, dung môi được sử dụng trong quá trình phân tích phải thuộc loại tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký (HPLC grade). Nước sử dụng phải là nước cất hai lần hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (đạt tiêu chuẩn nước loại 1 dùng cho phân tích phòng thí nghiệm).
• Chất chuẩn hóa học:
  • Naringin chuẩn: Có độ tinh khiết tối thiểu đã biết, dùng để chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc nhằm thiết lập đường chuẩn định lượng.
  • Neohesperidin chuẩn: Có độ tinh khiết xác định, dùng làm chất đối chứng để định lượng neohesperidin trong mẫu nước quả.
• Dung môi pha động: Thường là hỗn hợp của nước, axetonitril (acetonitrile) và metanol (methanol). Để tối ưu hóa quá trình phân tách và cải thiện hình dạng pic sắc ký, một lượng nhỏ axit hữu cơ yếu (như axit axetic hoặc axit formic) có thể được bổ sung vào pha động.
• Chuẩn bị và bảo quản dung dịch chuẩn: Tiêu chuẩn hướng dẫn chi tiết quy trình cân, hòa tan chất chuẩn để pha chế dung dịch chuẩn gốc (stock solution) và các dung dịch chuẩn làm việc (working solutions) ở các dải nồng độ khác nhau. Các dung dịch chuẩn này phải được bảo quản trong các lọ thủy tinh tối màu ở nhiệt độ thấp (từ 2 độ C đến 8 độ C hoặc đông lạnh) để tránh bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ.