Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11067:2016 về Thực phẩm chức năng - Xác định hàm lượng beta caroten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ban hành nhằm quy định phương pháp thử nghiệm thống nhất để xác định chính xác hàm lượng hoạt chất này trong các sản phẩm thực phẩm chức năng lưu hành trên thị trường.

Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng beta-caroten trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng áp dụng bao gồm các tổ chức, cá nhân sản xuất, kinh doanh, nhập khẩu thực phẩm chức năng và các cơ quan quản lý, phòng thử nghiệm liên quan tại Việt Nam.

Nguyên tắc của phương pháp phân tích

Phương pháp xác định hàm lượng beta-caroten dựa trên các nguyên tắc kỹ thuật sau:

• Chiết xuất beta-caroten ra khỏi nền mẫu thực phẩm chức năng bằng dung môi hữu cơ thích hợp.
• Tiến hành xà phòng hóa mẫu bằng dung dịch kiềm (nếu cần thiết) để giải phóng beta-caroten từ các dạng liên kết và loại bỏ các chất béo gây cản trở quá trình phân tích.
• Làm sạch dịch chiết và tiến hành phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột pha đảo (như cột C18 hoặc C30) kết hợp với đầu dò độ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) hoặc đầu dò mảng diod (PDA) ở bước sóng phát hiện tối ưu (thường là 450 nm).
• Định lượng hàm lượng beta-caroten bằng cách so sánh diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử với đường chuẩn của chất chuẩn beta-caroten tinh khiết.

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất yêu cầu

Để đảm bảo độ chính xác của phép đo, phòng thử nghiệm cần trang bị đầy đủ các thiết bị và hóa chất đạt tiêu chuẩn:

• Hệ thống HPLC đồng bộ có đầu dò UV-Vis hoặc PDA và phần mềm xử lý dữ liệu sắc ký chuyên dụng.
• Cột phân tích sắc ký pha đảo phù hợp cho việc phân tách các carotenoid.
• Các thiết bị phụ trợ bao gồm: máy lắc siêu âm, máy ly tâm, bộ cô quay chân không hoặc hệ thống thổi khí nitơ để làm bay hơi dung môi.
• Hóa chất, dung môi dùng cho sắc ký (đạt tiêu chuẩn HPLC) như axetonitril, metanol, tetrahydrofuran (THF), diclometan, nước cất siêu sạch.
• Chất chuẩn beta-caroten có độ tinh khiết cao đã biết rõ hàm lượng để thiết lập đường chuẩn.

Quy trình tiến hành thử nghiệm

Quy trình phân tích được thực hiện nghiêm ngặt qua các bước cụ thể sau:

• Chuẩn bị mẫu: Mẫu thử được đồng nhất hóa kỹ lưỡng. Cân một lượng mẫu đại diện chính xác tùy thuộc vào hàm lượng beta-caroten dự kiến có trong sản phẩm.
• Chiết xuất và xà phòng hóa: Hòa tan hoặc phân tán mẫu trong dung môi. Thực hiện quá trình xà phòng hóa bằng dung dịch kali hydroxit (KOH) trong môi trường cồn để loại bỏ chất béo, sau đó chiết lấy beta-caroten bằng dung môi hữu cơ kém phân cực (như ete dầu mỏ hoặc hexan).
• Chuẩn bị dịch tiêm sắc ký: Dịch chiết sau khi rửa sạch bằng nước và làm khan được cô khô dưới dòng khí nitơ hoặc cô quay chân không ở nhiệt độ thấp (tránh ánh sáng trực tiếp). Hòa tan lại cặn trong dung môi pha động thích hợp và lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.
• Phân tích trên hệ thống HPLC: Thiết lập các điều kiện vận hành hệ thống HPLC (tốc độ dòng, nhiệt độ cột, bước sóng phát hiện). Tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử vào hệ thống để tiến hành phân tích và ghi lại sắc ký đồ.

Tính toán và biểu thị kết quả

Hàm lượng beta-caroten trong mẫu được tính toán dựa trên diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu thử so với đường chuẩn của chất chuẩn beta-caroten. Công thức tính toán phải tính đến các yếu tố như khối lượng mẫu cân, thể tích định mức cuối cùng, độ pha loãng và độ tinh khiết của chất chuẩn sử dụng. Kết quả được biểu thị bằng miligam trên kilôgam (mg/kg) hoặc miligam trên đơn vị phân liều tùy thuộc vào dạng sản phẩm.

Yêu cầu đặc biệt về an toàn và thao tác

Do beta-caroten là hợp chất rất nhạy cảm với ánh sáng, nhiệt độ và oxy không khí, quy trình phân tích cần tuân thủ các lưu ý đặc biệt:

• Toàn bộ quá trình chuẩn bị mẫu, chiết xuất và phân tích phải được thực hiện trong điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp (sử dụng dụng cụ thủy tinh màu hổ phách hoặc bọc giấy bạc).
• Tránh để dung dịch chứa beta-caroten tiếp xúc lâu với nhiệt độ cao.
• Sử dụng các chất chống oxy hóa (như BHT - butylated hydroxytoluene) thêm vào dung môi chiết để bảo vệ beta-caroten không bị phân hủy trong quá trình xử lý mẫu.

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11067:2016 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Tiêu chuẩn này có hiệu lực kể từ ngày ban hành và là căn cứ kỹ thuật quan trọng cho các phòng thử nghiệm, cơ quan quản lý và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng tại Việt Nam.