TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10783-2:2015

ISO/TS 15216-2:2013

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH VIRUS VIÊM GAN A VÀ NOROVIRUS TRONG THỰC PHẨM SỬ DỤNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE PHIÊN MÃ NGƯỢC THỜI GIAN THỰC - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỊNH TÍNH

Microbiology of food and animal feed - Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR - Part 2: Method for qualitative detection

Lời nói đầu

TCVN 10783-2:2015 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 15216-2:2013;

TCVN 10783-2:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 10783 (ISO/TS 15216), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Xác định virus viêm gan A và norovirus trong thực phẩm sử dụng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực gồm các phần sau đây:

- TCVN 10783-1:2015 (ISO/TS 15216-1:2013), Phần 1: Phương pháp định lượng;

- TCVN 10783-2:2015 (ISO/TS 15216-2:2013), Phần 2: Phương pháp phát hiện định tính.

Lời giới thiệu

Virus viêm gan A (HAV) và norovirus (NoV) là các tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm cho người. Chưa có phương pháp thông thường để nuôi cấy các virus này từ nền mẫu thực phẩm. Do đó, việc phát hiện phải dựa trên phương pháp phân tử, sử dụng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR). Vì nhiều nền thực phẩm chứa chất gây ức chế phản ứng RT-PCR, nên cần sử dụng phương pháp tách chiết để thu được ARN tinh sạch cao phù hợp với mục đích sử dụng. Đối với bề mặt thực phẩm, loại bỏ virus bằng cách dùng gạc lau. Đối với quả mềm và rau salat, tách chiết virus bằng cách rửa giải đồng thời khuấy trộn sau đó cho kết tủa với PEG/NaCl. Đối với nước đóng chai, hấp thụ và rửa giải sử dụng màng lọc tích điện sau đó cô đặc bằng bộ lọc màng cực tím và đối với động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ, thì tách chiết virus ra khỏi các mô của tuyến tiêu hóa có xử lý bằng dung dịch proteinase K. Đối với tất cả các nền mẫu không đề cập trong tiêu chuẩn này, cần phải đánh giá xác nhận lại phương pháp này. Tất cả các nền mẫu sử dụng cùng một phương pháp tách chiết ARN thường dựa trên capsid virus phân rã với thuốc thử chaotropic, sau đó hấp thụ ARN từ các hạt silica. Kiểm soát quá trình phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực (real-time RT-PCR) khuếch đại qua chuỗi PCR bằng cách đo độ kích thích của phân tử được đánh dấu huỳnh quang. Trong phép phân tích real-time RT-PCR phát huỳnh quang 5’ nuclease, các chất đánh dấu huỳnh quang được gắn vào mẫu dò nucleotid có trình tự đặc hiệu (mẫu dò thủy phân) cũng có thể nhận biết đồng thời với khuôn mẫu đích. Sự cải biến này làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR và cần phòng ngừa đối với các bước nhận biết sản phẩm khuếch đại tiếp sau phản ứng PCR. Vì sự phức tạp của phương pháp, nên cần có một bộ kiểm soát toàn diện. Phương pháp mô tả trong tiêu chuẩn này có thể phát hiện định tính ARN virus trong mẫu thử. Sơ đồ của quy trình thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH VIRUS VIÊM GAN A VÀ NOROVIRUS TRONG THỰC PHẨM SỬ DỤNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE PHIÊN MÃ NGƯỢC THỜI GIAN THỰC - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỊNH TÍNH

Microbiology of food and animal feed - Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR - Part 2: Method for qualitative detection

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện định tính HAV và NoV các nhóm gen I (GI) và NoV các nhóm gen II (GII), từ mẫu thử thực phẩm hoặc bề mặt thực phẩm. Sau khi virus giải phóng ra khỏi mẫu thử, ARN virus được tách chiết bằng cách phân giải trong guanidin thiocyanat và hấp phụ trên cột silica. Trình tự đích trong ARN virus được khuếch đại và phát hiện bằng phản ứng real-time RT-PCR.

Ti